四种南方根结线虫生防菌菌株的筛选研究 第三稿

1、四种南方根结线虫生防菌菌株筛选研究四种南方根结线虫生防菌菌株筛选研究摘 要线虫的生物防治是近几年植保领域的热点之一，本文从采自洛阳市李楼蔬菜基地的根际土壤样本中分离、筛选出了4株对南方根结线虫具有明显拮抗效果的生防细菌菌株，并对这4株生防菌进行了一系列的生理生化指标检测。初步检测结果如下：假单胞菌属（18-4）、巨大芽胞杆菌属（15-5）、蜡样芽胞杆菌属（20-7）、枯草芽孢杆菌属（2-1）。该结果为下一步开发防治南方根结线虫的生物制剂提供了理论依据，利于减少传统化学农药过度使用而导致的“3R”问题。关键词：根结线虫；生物防治；根际生防细菌；筛选； 1 引言通过有关植物线虫病害知识的问卷调查发

2、现，现在农户中对于植物寄生线虫所导致的病害中了解程度不够，对于线虫病的危害没有一个清晰的认识，而相反植物寄生线虫已经是导致植物病害的第二大杀手，不仅能引起植物线虫病，同时他也能为植物病原细菌和真菌提供侵染途径，也是很多植物病毒的传播介体。传统的防治线虫病害的方法一般都是采用传统化学农药，化学方法防治植物寄生线虫具有防治好，见效快的特点，但是不可避免的污染了自然环境，因此生物防治越来越引起广泛的关注。利用对植物寄生线虫具有明显拮抗效果的生防细菌对植物寄生线虫进行防治是当今新的研究热点。种类繁多的细菌从寄主植物、线虫体、线虫的卵、土壤中上被分离，不同的作用方式被报道。自然界中存在有许多对植物有益的

3、细菌群落，在农业生态系统中，充分利用这些细菌的生物学潜力来控制植物寄生线虫的种群数量将有助于减少化肥和农药投入、促进植物生长、减轻对环境的污染，实现农业可持续高效的发展。本研究首先从蔬菜的根际土壤中分离细菌，通过室内离体实验的方法验证其防效，同时对线虫有拮抗作用的细菌进一步鉴定。本次研究的结果能在一定程度上为开发新型防治线虫的生物制剂提供理论依据。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 土壤样本与供试线虫来源及处理土壤样本采自洛阳市李楼蔬菜基地的蔬菜大棚中，样本土壤均为蔬菜大棚的根际土壤。在蔬菜收获后，采用十点取样法从515 cm的土层中采集作物根际土壤，共采集30份土样，土样自然风干后过200

4、目筛，然后封装于密封袋中并编号，置于4 冰箱保存备用。从样本土壤中分离得到细菌菌株50种，其中对植物寄生线虫具有拮抗效果的菌株有4种，编号分别为2-1、15-5、18-4、20-7。将其接种于LB固体培养基上，置于4冰箱冷藏室保存备用。供试线虫为南方根结线虫，保存于本实验室中。2.1.2 供试培养基培养基具体配方如下表（表1）所示：表1 供试培养基种类及成分培养基名称成 分LB液体培养基胰蛋白胨10 g、酵母膏 5g、NaCl 5 g、蒸馏水1000 mLLB固体培养基胰蛋白胨10 g、蒸馏水1000 mL、酵母提取物5 g、NaCl 5 g、琼脂粉18 g休和利夫森二氏培养基蛋白胨2 g、N

5、aCl 5 g、K2HPO4 0.2 g、葡萄糖 10 g、琼脂20 g、溴百里酚蓝1% 水溶液3 mL、蒸馏水1000 mL葡萄糖蛋白胨液体培养基蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，K2HPO4 5.0 g，蒸馏水1000 mL淀粉培养基在 LB 固体培养基中加入2 g 可溶性淀粉柠檬酸盐培养基NH4H2PO4 1 g，K2HPO4 1 g，NaCl 5 g，MgSO4 0.2 g，柠檬酸钠2 g，琼脂18 g，蒸馏水1000 mL。2.2 试验方法2.2.1 根际细菌的分离根际土壤细菌的分离一般采用稀释涂平板法，具体实验方法步骤如下：（1）稀释液的制备：称取土样5 g，并将土壤磨成粉末状，

6、放入50 mL去离子水中，摇床上振荡30 min，静置使澄清，用无菌枪头吸取上清液100 µL并加入900 µL无菌水中，用无菌水稀释为10-1 10-2 10-3 10-410-5 五个浓度梯度并保存。（2）培养：吸取各浓度稀释液200uL涂布于LB固体培养基制成平板，拿封口膜封口后倒置于恒温箱内，37培养24h。（3）挑菌落：挑取单细菌菌落于新的LB培养基中，37恒温培养24h。（4）菌株的纯化：尽量挑取形态不同的单菌落于液体LB培养基中，37、200r/min摇床振荡培养，然后用平板划线分离法进行纯化，直到获得纯培养。2.2.2 寄生线虫拮抗细菌的筛选取纯化的细菌接种

7、于装有LB液体培养基的试管中，37 、200r/min摇床中培养24h，然后于无菌超净工作台上用移液枪取600 µL培养液于Landy培养基（加100 µL KH2PO4、1000 µL 40%葡萄糖）中，37 摇床中震荡培养48 h，取出后静置，取上清液于离心管中，10000 r离心10 min，用移液枪取上清液于凹面皿、备用10。挑取2040条线虫于凹面皿上清液中，置于26 恒温培养箱内，处理12 h、24 h和48 h后分别观察和计数。由于供试线虫中存在假死现象，我们必须在解剖镜下用自制挑针刺激线虫，如果线虫个体僵直不动，则可以记做死亡，若呈弯曲状则为假死状

8、态。生测结果计算参照陈立杰等人的方法11。线虫死亡率 (%) = 死亡线虫数供试线虫数×100%2.2.3 细菌各项生理生化指标的鉴定共选取甲基红（VP）、乙酰甲基甲醇（VP）、吲哚的产生（细菌对色氨酸的利用）、淀粉水解、葡萄糖的氧化发酵、产氨实验、柠檬酸盐的利用这七项指标检测，参照微生物学实验指导中提到的实验方法，对待测菌株进行该七项指标的鉴定试验12。3 结果分析3.1 土壤细菌的分离和纯化采用稀释平板法对30份土壤进行细菌的分离和纯化，纯化细菌划线培养保存。由下图（图1）显微镜观察可以看出所挑选出的4个植物寄生线虫的拮抗细菌的单菌落形态各不相同，颜色也都不一致，每一种细菌都具有

9、各自独特的形态特征：2-1细菌单菌落呈微椭圆形，菌落整体颜色较为一致，为浅黄色，边缘整齐，表面无褶皱，菌落较为湿润，稍浑浊，呈半透明状；15-5细菌单菌落呈圆形，菌落整体颜色一致，为从中心到边缘皆为灰黑色，边缘有突起，表面无褶皱，菌落较为湿润，不透明；18-4细菌单菌落呈圆形，菌落中心为灰黑色或黑色，由中心向边缘颜色逐渐变浅，边缘呈浅黄色，菌落边缘呈不规则形状，有突起，表面有褶皱，菌落中心不透明，边缘为半透明状，菌落中心较边缘部分略厚；20-7细菌菌落不规则，菌株呈发散性生长，无明显的菌落中心，菌落浅黄色。菌落边缘向四周发散生长，菌落透明。 图1主要拮抗细菌单菌落3.2 拮抗细菌的筛选将分离得

10、到的50个菌株分别进行实验室内寄生线虫离体抗性筛选： 用37 200 r/min恒温摇床条件下培养48h得到细菌发酵上清液，将线虫置于该发酵上清液中放在26恒温培养箱中培养，12 h、24 h、48 h后分别观察结果，结果表明，不同细菌发酵液对线虫的抑制效果不同，其中2-1、15-5、18-4、20-7这4个菌株的发酵液对线虫的抑制效果最为明显，四种细菌在48h内作用效果如下表（表2）：表2 拮抗细菌菌株上清液对植物寄生线虫的活性处理线虫死亡率Nematode mortality(）Treatment12 h24 h48 h2-194.44±0.94100.00±0100.

11、00±015-580.56±1.1396.44±2.36100.00±018-460.78±1.3595.00±2.15100.00±020-750.78±1.4591.66±1.95100.00±0CK0.00±00.00±00.00±0注：（1）CK：无菌水对照；（2）LANDY培养基上重复实验5次4种细菌的发酵上清液在48h内对线虫的致死率均达到了100%。编号15-5、18-4、20-7在12 h 的时候相对防治效果分别为：80.56%、60.78%、50.

12、78%，而编号为2-1的菌株的上清发酵液在12 h 内对植物南方根结线虫的致死率高达94.44%。得到的4株对植物寄生线虫具有拮抗作用的细菌中编号为2-1的细菌拮抗效果最为明显。防治效果同时表明这4个拮抗细菌菌株在接种后024h内对植物寄生线虫的防治效果呈上升趋势，由此表明这些拮抗细菌菌株对植物寄生线虫的防控具有较长的持效期。3.3 主要拮抗细菌革兰氏染色革兰氏染色法：对各主要拮抗细菌样品的染色玻片在显微镜的油镜下观察结果如图（图2）。图2拮抗细菌革兰氏染色后油镜观察图表3 拮抗细菌革兰氏染色编号革兰氏染色颜色鉴别结果（+/-）15-5紫色+2-1紫色+18-4红色-20-7紫色+注：“”代表

13、阳性；“”代表阴性根据表2的结果说明：植物寄生线虫拮抗细菌既有革兰氏阳性细菌，又有革兰氏阴性细菌,其中15-5、20-7、2-1为革兰氏阳性， 18-4为革兰氏阴性。革兰氏阳性细菌占75%，革兰氏阴性细菌占25%。初步判断自然界中对植物寄生线虫有拮抗作用的细菌大多为革兰氏阳性菌。3.4 细菌的生理生化特征鉴定共有待测菌株4种，编号分别为2-1、15-5、18-4、20-7分别测定其甲基红（VP）、乙酰甲基甲醇（VP）、吲哚的产生（细菌对色氨酸的利用）、淀粉水解、葡萄糖的氧化发酵、产氨实验、柠檬酸盐的利用这7项生理生化特征，得到结果如下表（表3）所示由下表可知：在已经测定的4株对植物寄生线虫具有

14、明显拮抗效果的细菌菌株中，甲基红实验除了18-4外都呈现阴性结果；乙酰甲基甲醇的实验结果均为阴性；吲哚的产生实验除了2-1为阳性外，其余样本均为阴性；葡萄糖的氧化发酵实验4种菌均为氧化型；2-1和15-5在柠檬酸盐培养基上呈阳性反应，18-4和20-7在柠檬酸盐培养基上不能正常生长，不能利用柠檬酸盐。对照以上7项生理生化特征的鉴定结果，查阅伯杰明细菌鉴定手册，该4个菌株的鉴定结果为：单胞菌属（18-4）、巨大芽胞杆菌属（15-5）、蜡样芽胞杆菌属（20-7）、枯草芽孢杆菌属（2-1）.表4 待测细菌菌株生理生化指标鉴定结果生理生化特征菌株编号甲基红乙酰甲基甲醇吲哚淀粉水解葡萄糖的氧化发酵产氨实

15、验柠檬酸盐的利用2-1-+O+15-5-+O+18-4+-O+-20-7-+O+-符号：+，90%菌株阳性；-，90%菌株阴性；d，1189%菌株阳性；+w，阳性弱反应；O，氧化型；F，发酵型。部分指标实验结果如下图（图3）所示：图3 甲基红（VP）实验结果4 结论与讨论本研究采用稀释平板法13对所采取的土样进行细菌菌株分离与纯培养，最终得到50株形态或颜色各不相同的单菌落，说明植物的根际土壤中存在着种类繁多的微生物品种。通过试验筛选出4株对植物寄生线虫具有明显拮抗作用的细菌编号为2-1、15-5、18-4、20-7，这4个菌株的发酵液对线虫的抑制效果最为明显，这4种细菌的发酵液在48h内对线

16、虫的致死率均达到100%。其中编号为2-1的菌株的发酵上清液在12h内对植南方根结线虫的致死率高达94.44%，具有较好的防治效果和防治潜力。革兰氏染色结果：除了18-4为革兰氏阴性外，其余3种细菌均为革兰氏阳性细菌，由此可以初步的判断自然界中存在的拮抗植物寄生线虫的细菌大多为革兰氏阳性菌。通过接下来对其生理生化指标的测定，对该四个菌株的鉴定结果为假单胞菌属（18-4）、巨大芽胞杆菌属（15-5）、蜡样芽胞杆菌属（20-7）、枯草芽孢杆菌属（2-1）。前人研究证实，植物寄生线虫拮抗细菌有芽孢杆菌和荧光假单胞杆菌等。本实验的拮抗能力测定实验结果表明，菌株2-1能有效的控制植物寄生根结线虫的种群数

17、量，同时控制时效较长。不过尽管如此，但是该菌株是否能开发为相应的生物制剂进行商品化生产，还需经过进一步的研究去探究；而且该拮抗菌株对线虫的作用方式和作用机理也有待进一步的探究。因为尽管在实验室条件下该菌株对植物寄生线虫具有良好的生物防治作用16,17，当时实际应用效果应该结合大田中土壤微生物数量，土壤理化性质，以及环境条件等各方面的条件来综合考虑18。只有综合考虑各方面条件，制定合理的使用方法与使用数量，才能获得最佳的防治效果。因此，本实验虽然筛选出了具有明显拮抗作用的细菌，但是也有不足之处。由于室内试验测定没有考虑大田环境中的土壤理化性质，作物因素以及其他植物的影响等条件，若进一步深入的研究

18、其作用机理及方式，则对土壤跟及线虫的生物防治工作会产生很大的启示。为了更有效的防治植物寄生线虫病害，我们必须运用有害生物综合防治策略（IPM），综合考虑环境，作物，病原物三者间的关系，制定有效的综合防治策略，综合合理的总用各种防治手段，达到最大的经济，环境收益，也响应了我国21世纪植物保护工作的综合方针；响应了当今潮流，采用高效、持久的生物防治手段对植物线虫病害进行防治。参考文献1 安川,永春柑橘根部15种线虫记述及线虫分离新技术的研究D.厦门.厦门大学2009.2 许志刚.普通植物病理学M.北京:中国农业出版社,2009:219-220. 3 钟爽,曾会才,等.香蕉植物线虫病的防治技术 C.

19、 中国植物病理学会2010年学术学会论文集. 2010.4 陈立杰，段玉玺;不同细菌菌株对大豆根腐病菌及胞囊线虫病的影响J.沈阳农业大学学报,2006, 6; 435-437.5 郑云峰,李建生,邱美强,等.根结线虫生防菌研究进展J.中国农村小康科技,2006(11):62-65.6 郭荣军,刘杏忠；应用根际细菌防止植物寄生线虫的研究J. 中国生物防治1996,12(9): 134-137. 7 梁建根,郑经武,等.设施栽培中蔬菜根结线虫生物防治研究进展J.中国农学通报,2010.8 郑云峰,李建生.等.根结线虫生防菌研究进展J.中国农村小康科技.2006，11-13.9 Aravind R,Eapen S J,Kumar A.Screening of endopHytic bacteria and evaluation of selected isolates for suppression Of bu