真空微波辅助提取HPLC分析石蒜中生物碱

1、真空微波辅助提取一hplc分析石蒜中生物碱霍茵汪军霞李攻科（屮山大学化学与化学工程学院，广东广州5 1 0 2 7 5 ）摘要本文建立了真空微波提取-hplc联用技术分析石蒜中成分的分析方法。确定最优提取条 件为：20 ml甲醇，样品颗粒度为6080 mesh,提取时间10 min,提取温度75 °c和初始真空 度0.05 mpa。对于石蒜碱、力可拉敏和加兰他敏，vmae/hplc分析线性范围分别是10400、 10-500和10200pg ml",检出限分别是4.93、7.40和8.13pg ml“，回收率分别为57.4%、 93.8%和100.3%, rsd分别为3.5

2、%、5.2%和10.2%。用优化的实验条件比较了真空微波提取 石蒜与普通微波提取和传统溶剂回流提取石蒜的提取率的差别。而从扫描电镜图看出，vmae、 mae与传统热回流提取都没有使石蒜细胞破壁。关键词真空微波提取（vmae）,高效液相色谱（hplc）,石蒜石蒜（lycoris）属于单子叶植物石蒜科，主要含生物碱、蜕皮綃酮、脂肪酸、淀粉等。据本 草纲日等记载，石蒜具有解毒、祛痰、利尿、催吐等功效，主治痈疮恶核、咽喉肿痛、水肿等， 现代人们对石蒜科的生物碱成分进行了广泛的药理活性研究，认为其具有中枢神经系统作用、心 血管系统作用、抗癌抗肿瘤作用、抗菌、抗病毒作用等。传统石蒜屮生物碱的提取方法浸提时

3、间 长，溶剂用量大。利用微波辅助技术作样品前处理国内外已有不少文献报道h引。微波辅助技术处理样品的最 突出特点是反应速度极快，节时和节能，产率高，而且环境友好。其中微波辅助提取萃取（mae）作 为一种有机成分提取的新技术，在环境、食品、制药等领域中得到了广泛的应用。由于微波提取加热迅速，使提取物瞬间达到很高的温度，致使一些热不稳定性物质会在高温 下分解，所以微波提取不利于提取热敏性物质。真空微波提取技术是微波技术和真空技术有机的 结合，它兼备了微波加热快、均匀及真空条件下低温提取的优点。真空微波提取与传统微波提取 的主要差别是真空微波提取将萃取罐内的空气抽去，使罐保持无氧或少氧的状态，以避免提

4、取液 与空气中的氧发生氧化作用。另一方面，山于罐内的大气压较低，在较低温度就能达到溶剂的沸 点，所以提取温度较传统微波提取低，避免了高温对有些热敏性物质的损坏。本文建立应用vmae对石蒜中的牛物碱提取进行研究。对影响vmae的条件样品颗粒度、 提取温度、提取时间、初始真空度和相对水分含量进行了优化筛选,并与普通微波提取和传统溶 剂回流提取进行了比较。并从sem图，初步探索vmae的机理。1材料与方法1.1材料和仪器1材料：广东石蒜（广东天普生物制药公司提供），经过组织捣碎机捣碎后，网筛分成不同粒径 的颗粒物。1.1.2试剂：氢漠酸石蒜碱标准品，氢漠酸加兰他敏标准品（sigma公司）；力可拉敏对

5、照品（广 东天普生物制药公司提供）；甲醇，盐酸，浓氨水，乙酸，三乙胺，三氯甲烷（广州化学试剂厂, 分析纯）；怡宝纯净水（深圳怡宝公司）。1.1.3仪器：lc-loatvp高效液相色谱仪（shimadzu, japan ）配spd-ioavp紫外检测器，*基金项冃：国家口然科学基金（20375050）,国家重点呈础研究发展项冃（g2000026302）,中山大学化学与化学工程学院创新基金。mars-x微波提取仪（cem, usa）, xl-30环境扫描电子显微镜（philips,荷兰），r201旋转蒸 发仪(上海巾科机械研究所)；phs-3c型酸度计(上海雷度仪器有限公司)，配雷磁牌e-201-

6、c 型ph复合电极(上海精密科学仪器有限公司)，组织捣碎机(上海模型标本厂)，ap-02b型真 空泵(autoscience,天津)。1.1.4真空微波提取装置：本实验采用改装mars-x系统的内罐，在进行微波萃取前，用真空泵 将罐内空气抽出，使罐内保持一定的真空度。1.2样品处理方法121真空微波提取：准确称取2 g石蒜样品放入萃取罐中，加入一定体积的提取溶剂，按照正交 实验表中的真空度条件对萃取罐进行抽真空，然后进行微波提取。冷却后，取出萃取罐，将提取 液过滤。1.2.2常压微波提取：准确称取2 g石蒜样品放入萃取罐屮，加入一定体积的提取溶剂，在75 °c 下微波提取10 min

7、。冷却后，取出萃取罐，将提取液过滤。1.2.3乙醇加热回流提取：准确称取2 g石蒜样品，放入圆底烧瓶中，加入一定体积的提取溶剂, 75 °c水浴加热回流30 min,将提取液过滤。1.2.4净化提取过程：将过滤后母液旋转蒸干，用15ml2%(体积比)的盐酸溶解，转移到分液漏 斗屮，用氯仿提取(10 ml) 3次，分出氯仿层，将水层用浓氨水调节ph值为1().(),再用氯仿 提取(loml) 3次，合并氯仿层，旋转蒸发，用甲醇定容至5ml,再用0.45 um滤膜过滤。1.3色谱条件色谱柱为diamonsil-c18柱(200 mmx4.6 mm, 5 um),流动相比例(v/v)为甲醇

8、:水: 三乙胺(15:85:0.595),用乙酸调节ph值为7.0,流速1.0 ml -min1,柱温为室温，柱压13.0 mpa, 紫外检测波长232 nm,进样量10 ul。2结果与讨论2.1真空微波提取的条件优化表i真空微波提取石蒜中有效成分的正交实验设计及结果编号颗粒度 / mesh温度 / 9时间 /min初始真空度/ mpa加水量/%石蒜碱相对面积 (%)力可拉敏相对面积(%)加兰他敏相对面积(%)120404530.0405&060.459.9220 405550.051067.172.082.2320 4065100.062069.974.87&94204075

9、150.073061.683.495.6540604550.063()74.978.969.3640605530.072080.480.369.7740 6065150.041067.561.44&6840 6075100.05091.994.290.09608045100.0710100.0100.082.510608055150.06084.783.683.51160806530.053065.985.294.31260 807550.042077.785.482.1138010045150.052077.680.594.5148010055100.043085.385.3100.

10、01580100655().07073.776.191.71680 1007530.061085.883.191.8对微波提取的实验条件优化的第一 步就是选择合适的提取溶剂。因为叩醇 的损耗因子tan 6比较大，利用微波的总 效率高，另外牛物碱的盐在甲醇中的溶 解度也比较高。所以本实验选用甲醇为 溶剂。参考常压微波提取石蒜中加兰他 敏的实验结果，选取溶剂体积为20mlo 以石蒜粉碎后的颗粒度、提取温度、捉 取时间、表ii vmae石蒜中有效成分的优化条件有效成分颗粒度提取温度提取时间初始真度加水量/mesh/c/min/mpa/%石蒜碱60 8055100.0610力可拉敏60 8075100

11、.070加兰他敏80 10075100.0530初始真空度及水分含量为变量进行五因素四水平的正交实验，如表i(相对对峰面积= 峰面积xl0(%)。并得出优化后的vmae条件，如表ii。 最大峰删综合考虑同时提取石蒜碱、力可拉敏和加兰他敏三种有效成分，得到优化条件为：颗粒度 60 8() mesh,提取温度75 °c,提取时间10 min,初始真空度70 mpa,加水量为0。下面对各种影响因素进行讨论分析。2.1.1颗粒度的影响由图i所示，石蒜样品颗粒大小对石蒜碱和力可 拉敏的提取率影响是一致的，60 80 mesh为最佳颗 粒度。若颗粒太大微波难以完全穿透样品，提取溶剂 难以在短时间

12、内扩散到样品内部，因此提取率低。随 着颗粒的减小，整个基体被溶剂浸润所需的时间缩 短，因此提取率提高。但当颗粒继续减小时，样品颗 粒间空隙过小增强了扩散阻力，且颗粒度过小，过滤 时易造成提取物的损失，这些因素都使得提取率降 低。而加兰他敏的提取率则是随着颗粒的减小先降低 后升高。2.1.2提取温度影响高温使提取成分从基体的解吸速率以及扩散至 溶剂中的速率显著增强。从而提高了微波致热提取的 速率,大大减少了提取所需的时间。图ii表明75 °c为 最佳的提取温度。2.1.3提取时间的影响从图山看出，在10 min内提取率已达最高，当大 于10 min提取率反而下降。这可能由于石蒜中含有

13、较多的淀粉类物质，在微波提取过程中逐渐溶胀，体 积逐渐增人，提取时间过长容易使被提取出来的物质 又被吸附，导致提取率降低。因此10 min为最佳提 取时间。2.1.4提取初始真空度的影响was (iiesh)叵石蒜穂力可拉敏石眶他敏4五£*益«!提取温皮cc)石蒜磁力可拉敏 加兰他敏图i样品颗粒大小对提取率的影响a ii提取温度对提取率的影响图ni提取时间对提取率的影响0.040.050.060.07初始真空度(mpto咅蒜破口力可拉敏加兰他敏图iv提取初始真空度对提取率的影响2 1 8 6 4 2 0 蓍)图iv所加，石蒜碱和力克拉敏的提取率大致随初 始真空度的升高而增大

14、，可能因为初始真空度越高， 溶剂沸点越低，开始提取的瞬间溶剂沸腾的程度越高, 越容易将待提取物从基质中提取出来。而初始真空度 对加兰他敬提取率的影响没有一定规律。2.1.5样品相对水分含量的影响从图v看出，加水量对三种物质的提取率影响不 是很大，这可能由于石蒜细胞中含有较多的水份，所 以加水量对石蒜中物质的提取影响不大。1.20102030加水 5| 有蒜破 ®力可拉敏 口加兰他敏|图v相对水分含量对提取率的影响2.2定性和定量分析 2.2.1定性分析实验采用lc-loatvp在相同仪器操作条件下, 根据保留时间进行定性。图vi石蒜样品及混合标准的hplc图（a图为实际样品色谱图，b

15、图为浓度为200聘mlj混合标样色谱图。1-石蒜碱；2-力可拉敏；3-加兰他敏）2.2.2定量分析 2.2.2.1线性范围、检出限、精密度和回收率用储备液配制1、10、50、100、200、300、400、500 u gml/的泯合标准溶液，按真空 微波提取的方法进行测定。以峰面积对浓度做标准曲线，用最小二乘法得回归方程，并确定方法的线性范围。用1 pginl“的混合标准溶液进样6次，计算标准偏差的3倍再除以标准曲线斜率得检出 限。准确称取2g石蒜样品，加入相当于其石蒜碱、力克拉敏和加兰他敏含量的工作液，以优化的vmae条件处理，按真空微波提取的方 法进行测定。重复6次，计算回收率。准确称取2

16、 g石蒜样品，以优化的 vmae条件处理，按真空微波提取方法进行 测定。重复6次，计算rsd。结果列于表iii。从表iii中数据看出，石蒜碱的回收率比 较低，可能山于石蒜碱是热敏性物质，在提 取过程中部分分解，所以本实验所用的真空 微波提取装置和方法仍需要改进。提取率（mg/g）120.74().13线性范围(pg ml；1) | o400 10 500 10 200检出限(pg ml1)4.937.40&13回收率（）57.493.8100.3rsd (%,n=6)3.55.210.2表m方法的线性范围、检出限、精密度和回收率石蒜碱 力可拉敏 加兰他敏2.3 vmae与溶剂回流法及普

17、通微波提取法的比较称取2 g石蒜样品，按同样的实验条件分别进行真空微波提取、溶剂冋流法提取以及常压微 波提取，实验结果列于表iv。表iv可以看出，真空微波提取、溶剂回流法提取以及常压微波提取 对三种待测组分的提取率差别不大。表iv几种萃取方法的比较vmae溶剂回流萃取mae萃取条件60 80 mesh, 20ml甲醇60 80 mesh, 20 ml'f'r?60 80mesh, 20ml甲醇75 c, 10 min, 0.05 mpa7530 min75'c, 10 min121.091.13提取率力可拉敏0.740.750.74(nig/g)加兰他敏0.130.14

18、()5为了进一步研究真空微波提取的初步机理，我们还用扫描电子显微镜对vmae前后、传统热 回流和普通mae的石蒜样品进行扫描电镜实验，结果见图vd、训、ix、x。从图可见未经过微 波辐射的石蒜样品,其细胞结构基本完整，排列规则。而经过溶剂提取后的石蒜样品其细胞结构受 到不同程度的破坏，排列都没有原石蒜样品的细胞规则整齐，但都没有明显破壁现象。其中经过 vmae后的石蒜细胞体积有所收缩，并r细胞表而的吸附的杂质较少。而传统热回流和mae的石蒜细胞表面吸附的朵质较多。图vd石蒜原样品电镜图x500图vbix500图ix传统热回流后的石蒜样品电镜图x500图x mae后的石蒜样品电镜图x500普通热

19、回流方法是溶剂渗进牛物体的膜(细胞壁、膜等)与内部成份混合再将它们帶出膜的 过程虽然比较复杂，而微波法是微波穿透膜与细胞内的水和极性分子进行作用，使它们快速加热, 从而在膜内产生热差及高压，使膜破裂，提取剂与有效成份充分溶合。所以从理论上分析微波法 应比普通回流提取速度要快。但由扫描电镜图看出vmae. mae和普通热回流都没冇使石蒜细胞破壁，三种方法提取过程都是溶剂渗进生物体的膜(细胞壁、膜等)与内部成份混合再将它们 带出膜的过程，因此三种提取方法的提取率差别不大。至于vmae与mae都不能使石蒜细胞 破壁的原因可能与石蒜细胞壁结构有关。山局部过热产生的压力虽然能使细胞膨胀，但山于石蒜 细胞

20、壁有弹性，所以细胞壁在压力下没有破裂。虽然从vmae、mae和热回流对石蒜的提取率比较不能看出真空微波捉取的优势，但从扫 描电镜图可以看出，vmae后石蒜细胞表面吸附的杂质较少。由于vmae的萃取罐屮氧气含量 较少，有效防止了有效成分的氧化，既保护了有效成分又减少提取液的杂质成分，更有利于提取 后的纯化过程。2.4结论微波提取是近年发展起来的快速高效的样品预处理方法。mae操作简便、省时省溶剂，是提 取中药有效成分的一种高效的方法。而vmae更适合热敏性成分提取的。本实齡建立了vmae提 取、hplc分析检测石蒜中生物碱的方法。选取了甲醇为提取溶剂，并采用五因素四水平的正交设 计对影响真空微波

21、提取的因素，包括颗粒度、提取温度、提取时间、提取初始真空度和相对水分 含量进行了优化。在与溶剂回流法及普通微波提取相比，提取率差别不大。对于石蒜碱、力可拉 敏和加兰他敏，vmae/hplc分析线性范围分别是1()4()()、1()5()()和1() 20() jag ml，检出限 分别是4.93、7.40和8.13 pg -ml1,回收率分别为57.4%、93.8%和 100.3%, rsd分另为3.5%、5.2% 和10.2%。由于石蒜碱在提取过程中部分分解，回收率很低，所以要改进提取装置和方法，摸索更 适合热敏性物质的真空微波提取装置。参考文献i. ganzler k, salgo a.

22、valko k microwave extraction. a novel sample preparation method for chromatography. chromatogrj98637(l)： 299 - 3062 lopez-avila, v. young, r. kim, r. et al. accelerated extraction of organic pollutants using microwave energy, r j. chromatogr. sci.j995,33： 481 -484.3. zhang z, xiong g li g sample pre

23、treatment with inicrowavc-assistcd techniqucsuj. analytical sciences, 2000,16： 221.4. 王晓玲.微波技术在天然药物生产中的应用.中药研究与信息，2002, 1(1)： 22 - 24.5. 司夭梅，孙丽丽，张鸿燕等.高效液相色谱荧光检测法测定人血浆中漠酸加兰他敬浓度.中国临床药理学杂志，2002, 18(1)：66 - 69.6. 贾献裁，周铜水，郑颖等.石蒜科植物生物碱成分的药理学研究.中医药学刊，2001, 19(6)： 573 - 574.7. 徐小东，崔政伟.食品真空干燥装置及其进展.轻工机械，2000

24、. 1： 1 -4.8. 洪山海,马广恩.石蒜科生物碱的研究111.紫花石蒜和其他两种石蒜中的生物碱及新生物碱紫花石蒜碱.药学学报，1964,11(1)： 1 - 14.9. brachet a. christen p、 veuthey jl.focused micro wave assisted extraction of cocaine and benzoylecgonine fronie coca leaves phytochem anal,2oo2.13(3)： 162 - 169.10. guohua xiong, baoying tang, xiaoqing he ct al. c

25、omparison of microwave-assisted extraction of triazincs from soils using water and organic solvents as the extractant. taianta, 1999, 48： 333 339.ii. 李核，张展霞，李攻科.密闭式微波系统的微波辅助革取动力学模型.中山大学学报(自然科学版),2004, 43(3)： 4() - 44.12. 周文华，杨解荣，岳庆纭 生物碱捉取和分离方法的研究新进展.当代化工，2003, 32(2)： 111-114.determination of alkaloi

26、ds in lycoris by hplcusing vacuum microwave-assisted extractionhuo yin wang junxia li gongke*(school of chemistry and chemical engineering, sun yat-sen university. guangzhou 510275 china)abstract in this work, a method for the determination of alkaloids in lycoris by hplc using vacuum microwave-assisted extraction was developed the optimal vmae conditions were as follow: 20 ml of m