白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法探究

1、白术、苍术种子位点特异性pcr鉴别方法探 究摘要目的：筛选白术、苍术鉴别snp位点，并 设计特异性引物，实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法： 通过测序及genbank中下载获得白术、苍术的psb a-trn h 序列，通过使用bioedit软件比对获得snp位点，设计位点 特异性pcr引物，将its通用引物加入到特异性引物构建多 重pcr体系，并优化pcr条件，对白术、苍术种子进行分子 鉴定。结果：构建了多重pcr鉴别体系，通过一个pcr反应, 能扩增出苍术、白术约643 bp的its dna质控条带，扩增 出白术172 bp的特异性鉴别条带，实现白术、苍术鉴别。 结论：使用位点特异性pcr技

2、术可以有效鉴别白术、苍术种 子。关键词白术；snp；分子鉴定；种子收稿日期2013-02-28基金项目北京市科技专项“道地中药功能基因组北 京市重点实验室2012年阶梯计划项目”通信作者*袁媛,e-mail： yuanyuanicmm. ac. cn 中 药材白术是菊科 compositae 植物 atractylodes macrocephala koidz.的干燥根茎，多为栽培品，主要产于 浙江、安徽、湖北、湖南、江西等省。种子繁殖是白术传统 的生产方法，但目前许多药材种子都是自留种或从药材市场 购买，种子缺少足够的检测检验标准和合格包装1,存在 不少陈旧种子、不完全成熟种子或伪品2-3,

3、如何科学鉴 定中药材种子，建立中药材种子标准意义重大4。白术与其近缘种苍术种子形态上很相似，在实际生产和 种子销售中容易混杂。苍术来源植物为茅苍术a. lancea或 北苍术a. chinensis ,据2010年版中国药典记载， 白术和苍术在功效上存在显著差异5,因此如何准确鉴别2 种药材的种子，保证白术种质来源、避免种源混杂，对保障 白术药材质量以及安全用药具有重要意义。关于白术与苍术的鉴定研究已有报道6-7,但对于其 种子的来源鉴别研究鲜有报道。近年来，以分子生物学为基 础的检测方法被应用于药材鉴别中，特别是位点特异性pcr 可用于检测单个或多个位点的核昔酸变异，即可通过单个 pcr反应

4、区分药材的真伪品，已成功用于藁本8、石斛9、 金银花10等中药材的真伪品鉴别。本文通过使用位点特异 性pcr技术，利用白术与苍术的snp位点，实现2种药材种 子的分子鉴定，为白术种子质量标准制定提供参考。1材料白术种子于2011年购自于河北安国药市及2012年采自 湖南长沙，苍术于2011年采集自河南、湖北、山西、河北、 山东等地，材料来源及鉴定人见表1,凭证标本保存于中国 中医科学院中药资源中心。2方法2. 1 dna提取将干燥种子研磨成粉，取约0. 01 g粉末置于2. 0 ml的 微量离心管中，加入900 nl已灭菌的ctab提取液(2% ctab, 100 mmol - l-l tri

5、s-hcl, 20 mmol - l-l edta, 1.4 mol - l-1 nacl), 0.01 g pvp 40000, 10 ul b -疏基乙醇充分振荡 混匀，65 °c水浴1.01.5 h,期间轻摇23次。水浴结束 后取出，冷却至室温，加入900 nl酚-氯仿-异戊醇 (25 : 24 : 1),充分振荡混匀，12 000 xg离心10 min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(24 : 1),充分振荡混匀， 12 000 xg离心10 min。取上清，加入2/3体积预冷的异 丙醇溶液，-20 £放置0. 5 h以上。取出，12 000 xg离 心10 min

6、,弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，37 *挥干 乙醇，用适量灭菌水溶解，-20 °c保存。2. 2引物设计选择通用引物psb a-trnh对白术、苍术样品进行pcr 扩增并测序，获得 bz1-bz10, mcz1 mcz10, bcz1-bcz20 等40条序列；并于搜索表1试验材料table 1 plant samplesgenbank数据库中苍术属atractylodes的dna序列信 息，获得 2 条 a. lancea 的 psb a-trn h 序列(gu724247. 1； gq435071. 1),对所有白术、苍术序列进行多重比对，筛选 获得snp位点1个，为第175

7、 (a/t)位点，通过该位点设计 白术鉴别引物，引物设定参照相关方法进行，并引入错配 11 o同时使用its通用引物作为质控引物用于评价样品dna 的质量，见表2。表2引物序列table 2 primers in this paper注：r1引物“-3 ”端第二位“g”为错配碱基。2. 3 pcr扩增2. 3. 1通用引物psb a-trn h和its2 pcr反应体系： 扩增序列的通用反应体系：总体积25 ul,其中包括 10xbuffer 缓冲液 2.5 ul,dntp 20 nmol,引物各 2. 5pmol, r taq 酶 1 u, bsa 0.5 ul, dna 20 ng，灭菌蒸

8、镭水 17.8 ulo pcr反应程序：94 °c预变性4 min后，94c变性30 s, 55 °c退火40 s, 72 °c延伸1 min, 35个循环后72 °c延 伸8 mine获得pcr产物通过2. 0%的琼脂糖凝胶电泳，并用 eb染色观察。2. 3.2特异性pcr引物fl, r1 pcr反应体系与反应程 序同上，并考察不同退火温度(48.8, 49.3, 50. 1, 51. 1, 51.8, 52.6, 53.2, 54.6, 55.2, 56. 3, 57.2, 57.2 °c) 对特异性pcr扩增稳定性的影响。2.4多重pcr

9、鉴定体系建立及优化利用白术特异性引物fl, r1和通用引物its2f, its2r 构建多重pcr体系，用于白术，苍术的分子鉴定。优化pcr 反应体系，即在特异性pcr反应体系的基础上，分析dntp, 引物，dna模板，taq以及bsa浓度对pcr反应效率的影响, 筛选最适pcr鉴别条件。具体设计如下：dntp浓度2. 5, 5, 10, 15, 20, 30 nmol - l-1；引物浓度 2. 5, 5, 7. 5, 10, 15, 20 pmol - l-1； dna 模版浓度 100, 50, 20, 10, 5, 2. 5ng l-1； dna 聚合酶 0. 25, 0.5, 1,

10、2, 2.5, 3u； bsao, 1, 1.5, 2.5, 3.5, 5 ug l-1；引物总浓度为 20 pmol - l-1, 特异性引物与通用引物浓度比9 : 1,6 : 1,4 : 1,3 : 1,2 : 1, 1: lo2.5阳性和阴性对照制备分别将白术和苍术psb a序列连接到pmd19-t载体上， 获得重组质粒ampsba-pmd19 , alpsbapmd19。分别以 ampsba-pmd19, alpsba-pmd19质粒dna作为阳性和阴性对照 模板。2.6使用多重pcr鉴定体系进行鉴别使用以上建立的鉴别体系，对白术、苍术各样品进行鉴 别，同时用该体系鉴别白术、苍术的混合

11、dna样品，即将白 术dna按一定比例与苍术dna混合，考察pcr检出白术的dna 混合比例限度,混合后总dna质量浓度为20 mg-l-1,白术 所占比例为 1%, 5%, 10%, 50%, 90%, 95%, 99%o3结果分析3. 1白术、苍术特异性pcr鉴别由于在特异性pcr鉴别引物中，人为引入错配位点，因 此首先需要考察退火温度对pcr反应效率的影响，筛选能获 得白术特异扩增的退火温度。结果表明，特异性引物f1-r1 在退火温度48.857. 2 °c条件下均能扩增出专一的白术特 异性条带，其大小为172 bp,而在苍术样品中没有检测到扩 增产物。3.2白术多重pcr鉴别

12、体系本研究使用白术特异性引物作为鉴别引物、its通用引 物作为质控引物构建多重pcr体系，并对多重pcr体系进行 了优化。结果表明，。皿模板浓度在2.5100 ng - l-1均能 获得pcr扩增条带，且20 ngl-1浓度的扩增效果较好； 引物浓度520 pmol l-1均能获得扩增，其中10 pmol l-1 较好；特异性引物与通用引物浓度比为4 ： 1,即fl, r1为 8 pmoll-1, its2f, its2r为2 pmollt 时质控条带和 鉴别条带最清晰；taq酶0. 15 u, 35个扩增循环，dntp浓 度为10 nmoll-1能获得最佳扩增效果。3.3白术、苍术样品及混合

13、品分子鉴别使用上述建立的位点特异性pcr鉴别体系对各地釆集的 白术、苍术样品进行鉴别，结果表明茅苍术、北苍术均能扩 增获得643 bp的质控条带，而白术样品可同时获得质控条 带和172 bp的白术鉴别条带，从而实现白术与苍术的分子 鉴别。且am psb a-pmd19质粒dna作为模板，也可获得白 术鉴别条带，而al psb a-pmd19质粒dna作为模板不能获 得条带。由于实际生产中可能出现白术、苍术种子混杂的情 况，为了有效鉴别混杂品，本研究利用位点特异性pcr鉴别 体系对白术、苍术dna混合样品进行检测。结果表明，白术 样品dna在混合品中所占质量比为10%时能检测出白术特异 的鉴别条

14、带，且随着所占质量比增加，条带丰度增加，见图 lo14苍术；58.白术；915.不同比例白术、苍术dna 混合样品（白术所占比例依次为1%, 5%, 10%, 50%, 90%, 95%, 99%）o图1白术多重pcr鉴定fig. 1 multiplex pcr identification of atractylodes macrocephala4小结中药分子鉴别技术在中药材真伪鉴别中已经得到了良 好的应用12-14,位点特异性pcr方法的建立将使药材种 子真实性鉴别手段更加方便快捷，能很好的满足生产和质检 要求。本研究使用生物技术手段对白术种子的真伪来源进行 鉴别，建立了简便快捷的鉴别方法

15、，可作为传统形态鉴别的 补充，具有较强的推广价值，有利于白术药材种子质量标准 的建立。参考文献1 李秀凤，葛淑俊，王静华.药用植物种子标准化研究进展j中草药，2009, 40 (5)： 840.2 黄活军.药材种子的监管j湖南农业，2012, 22(7)： 13.3 翟树林，髙立霞，马丽虹.中药材种子、种苗常见 伪品j.现代中药研究与实践，2004, 18 (5)： 31.4 李隆云，彭锐，李红莉，等中药材种子种苗的发 展策略j中国中药杂志，2010, 35 (2)： 247.5 中国药典.一部s. 2010： 95.6 徐国均，袁昌齐，周太炎，等.中药苍术白术的生 药学鉴定研究j.药学学报，

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18、： 182.12 肖小河，刘峰群，贺承山，等.中药分子鉴定学概 论j.中药材，2000, 23 (2)： 109.l13肖培根中药分子鉴定评介j中国中药杂志, 2005, 30 (19)： 1559.14王川易，郭宝林，肖培根.中药分子鉴定方法评述 j.中国中药杂志，2011, 36 (3)： 237.authenticate of atractylodes macrocephala seed by amplification refractory mutation systemcao liangl, 2, jiang chao, peng hua-sheng, chen min, yuan

19、yuan (1. national resource center for chinese materia medica, china academy of chinese medicinal sciences, beijing 100700, china；2. institute of agricultural and biology resource utilization, hunan academy of agricultural sciences, changsha 410125, china；3. anhui college of traditional chinese medicine chinese, hefei 230038, china)abstract objective： to design specific primers and authenticate atractylodes macrocephala from atractylodes l