果酒(葡萄酒)的制作(精)

1、葡萄酒的酿造及其中酵母菌对发酵过程的影响实验设计方案一、前言：葡萄酒是用新鲜的葡萄或葡萄汁经发酵酿成的酒精饮料。通常分红葡萄酒和白 葡萄酒两种。前者是红葡萄带皮浸渍发酵而成；后者是葡萄汁发酵而成的。我们所 要酿造的是红葡萄酒。葡萄酒有增进食欲，滋补作用的作用。葡萄酒中含有糖、氨 基酸、维生素、矿物质。这些都是人体必不可少的营养素。它可以不经过预先消化 直接被人体吸收。非凡是对体弱者，经常饮用适量葡萄酒，对恢复-健康有利。同时还 有助于消化，葡萄酒能刺激胃酸分泌胃液，每60-100克葡萄酒能使胃液分泌增加120 毫升。自酿的葡萄酒，不用添加发酵剂，也不添加任何防腐剂和澄清剂。家酿的葡萄酒 利用葡

2、萄皮上的野生酵母菌分解葡萄中的糖份转化为酒精，另加点糖提高酒精度。 一般保质期不超过两年，所以成酒后应在两年内喝光。二、实验目的：1、熟悉酿造葡萄酒的过程和原理。2、学会葡萄酒中酵母菌的分离纯化。3、熟悉酵母菌形态观察和菌落计数法4、对比来说明，酵母菌对葡萄酒发酵的影响，杀菌剂（SO2对发酵过程的影响。三、材料和仪器：（一材料:葡萄3斤（因葡萄还未上市，可用提子代替，苏果超市有，但比较贵白糖半斤（二仪器:1、主发酵器：玻璃罐（坛、瓶、陶瓷坛、能耐受酒精又对人无害的塑料 瓶罐等均可。2、二次发酵容器及装酒的容器：可以用空酒瓶、饮料瓶、矿泉水瓶等都可3、一根细塑料管。用来在发酵完成后利用虹吸法将葡

3、萄酒从发酵容器中倒 出。4、木棒或筷子。用来在发酵过程中搅拌葡萄皮和葡萄汁。5、丝袜或细纱布。用来过滤葡萄酒汁。四、实验步骤:（一葡萄酒的酿造1、清洗:将主发酵器（即玻璃坛等充分洗干净，控干。2、浸泡:将葡萄摘除蒂，把剪好的葡萄冲洗干净后用淡盐水浸泡十分钟左右，这 是为了去掉葡萄皮上的农药和其他有害物质，再次冲洗，晾干至表面没有水珠。3、装瓶:将葡萄捏破,葡萄肉连同葡萄皮挤到主发酵器中。当把葡萄装到发酵 器容量的70%左右时,停止装葡萄，盖上盖子，但不要完全拧紧。24、发酵:将装好葡萄的发酵器放在28C恒温培养箱内。葡萄装入发酵器后，大 约会在12个小时以内启动发酵，表现为葡萄汁中有较多气泡产

4、生。在发酵启动后，每 天两次用木棒或筷子将葡萄皮压入酒液中，然后盖上盖子5、加糖:发酵启动后一到两天内，放入250g白糖，作用是提高酒精度。发酵启动 后三到四天时，再次放入白糖250g将糖浸入葡萄汁中搅拌均匀。6二次发酵:当酒精发酵完成后，首先利用虹吸法,将葡萄酒汁倒入二次发酵器， 然后将剩下的葡萄皮、籽、糟等用丝袜或细纱布过滤 ，过滤后的酒液也混入二次发 酵器中。葡萄皮、籽、糟扔掉。注意二次发酵器留有1/10空隙，盖子也不要拧的很紧。放在阴凉处。二次发酵主要是苹果酸-乳酸发酵，不再产生酒精。7、加入澄清剂，加入少量酒精。二次发酵完成，即得到葡萄酒原酒。8 口味： 自酿出的葡萄酒是酸的，还有一

5、些的刺激性味。附：葡萄酒的质量检测葡萄酒的质量指标是现行国家标准 GB/T15037-94中规定的检验指标；色泽:紫 红、深红、宝石红、红微带棕色澄清程度:澄清透明、有光泽、无明显悬浮物（使用软木塞封口的酒允许有3个 以下不大于1mm的软木渣。葡萄酒应是澄清的，若酵母菌生长,则会出现浑浊，所以 要检测出我们自酿的葡萄酒中酵母菌的含量是否合格。香气:具有纯正、优雅、怡悦、和谐的果香甜味：具有纯净、幽雅、爽怡的口味 和新鲜（二酵母菌的分离纯化1、制备葡萄酒稀释液取发酵2-3天时的葡萄酒液，称量1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中,充分振荡, 此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液 0.5m

6、L于4.5mL无菌水试管中， 用移液管吹吸三次 摇匀,此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程 需在无菌室或无菌操作条件下进行。（稀释倍数是根据微生物的数量进行选择，不固 定。可以直接涂布、或划线法分离纯化。2、涂布法分离（酵母菌定量分离用依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至 4550C的马铃薯葡萄糖培养基， 待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取三个不同稀释度（10-4,10-5,10-6菌悬液 0.1mL-0.2，依次滴加于相应编号已制备好的马铃薯葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒,左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养 皿平板表面将菌液自平

7、板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养观察接种后的所有平板倒置与适宜温度培养箱中培养。大约28-30度，时间两到三天。将葡萄分为两组发酵，一组为空白对照，另一组加入提取出的酵母菌，观 察其在发酵过程中酵母菌的生长对葡萄酒发酵时间的影响。4、酵母菌形态观察3将每个发酵阶段的葡萄汁用显微镜观察其中酵母菌的菌体特征（三酵母菌的检测利用血球计数法测定材料与仪器：葡萄酒汁，血球计数板，显微镜，盖玻片,无菌毛细管。操作步骤：1、镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。2、加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的

8、细口滴管将稀释的葡萄酒汁 由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室厂 般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。3. 显微镜计数静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在 位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀 ，需重新调节稀释 度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数 上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计 数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。4.

9、清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行 晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干 净,则必须重复洗涤至干净为止。实验结果：次数各中格中细胞数平均菌液浓度/（个/ml 12 3 4 5 1 2 3 4 5注意事项：1、各类容器一定要洗干净，葡萄在酿制过程中不能碰到油污、铁器、铜器、锡 器等，但可以接触干净的不绣钢制品。2、在发酵时，发酵器的盖子一定不要盖死，防止爆炸。3、糖不要多放，那样会影响发酵过程，产生我们不希望的成分，如果想喝甜葡萄 酒，可以在发酵完成后饮用时加糖五、具体操作过程和实验现象及分析（一第一次发酵：

10、葡萄的清洗，捏碎,装罐，加盖（稍微透氧做成两个瓶葡萄酒，一瓶对照（加入分离纯 化后的酵母菌，一瓶空白。将两个发酵罐放在 28恒温培养箱中发酵。注意不要太 用力搓洗葡萄，以防把葡萄皮上的野生酵母菌洗掉。每天都到实验室里，将浮在上面的葡萄按下去，以便皮上的酵母菌得到充分的利 用。加糖：第一次加糖发酵两天后，第二次发酵五天后。每次每瓶加 75克糖。（二第一次培养和观察:（1-3天实验准备:制备PDA培养基，火菌,低温保存;培养皿火菌，制备无菌水并保存。1、据实验方案,12小时后酒精发酵启动，所以1天后，我们提取了适量葡萄汁，进 行酵母菌的分离培养。取0.5ml的葡萄汁，梯度稀释成10-1,10-21

11、0-6,采用平板 涂布的方法，进行第一次培养。取10-4,10-5 10-6的三个梯度的稀释菌液进行涂布接 种,每个梯度三个培养皿。涂布完成后，放入28C恒温培养箱倒置培养，一到两天。2、葡萄汁的制片观察：取适量葡萄汁和无菌水混合，再附上载玻片，置于十倍镜下观察现象:由于葡萄汁成分非常多，所以镜头里背景很模糊，而且，只能观察到很少的 类似于酵母菌的单个细胞，放置于40倍镜下，观察也不是很清楚，其他大多是杂菌和 杂物在乱跑。（分析，发酵未真正启动，葡萄皮上的酵母菌，还未在葡萄汁中大量繁殖， 所以是视野里的现象模糊，酵母菌很少3、葡萄酒的观察现象从之前强烈的果香味转变为有淡淡的酒香味，而且3-4天

12、时，发酵罐中有大量的 气泡，葡萄皮颜色变暗,葡萄汁增多，且颜色更深。葡萄酒中的酵母菌的观察，此时,由于，酵母菌的大量繁殖，在显微镜的视野里已经 能,观察到很清晰的酵母菌个体，而且数量较多，图像背景亮了很多，（可能是酵母菌的 生长抑制了其他杂菌的生长，是的葡萄之中的杂质变得很少了。4、三天后，去取培养好的九个培养基，观察其中菌落的生长情况现象:实验结果似乎没有那么理想，培养基中的菌落，可谓五彩缤纷，有白色的菌 落,有黄色的粉状的菌落，有绿色的干燥的菌落，最多的就是黑色霉菌的菌落，散发出来 的味道更偏于霉菌的味道，而且，大多的菌落干燥，且成绒毛丝状。显微镜观察：尽量挑取一些，纯净的白色菌落的菌种，

13、和无菌水混合置于显微镜下 观察，发现，菌种不纯，有一些清晰可见的酵母菌细胞，但也参杂着一些霉菌的特征结 构。结果处理方案：挑取一些疑似的白色菌种，进行涂布培养，方法同上，培养1-2天。同时，也要再做一个备份，万一，白色的菌落不是酵母菌，所以，再取此时的葡萄汁， 再做六个培养基，进行培养，原理同上。（三第二次培养观察：（4-5天葡萄酒里发酵现象的观察：葡萄酒里产生了浓郁的酒精味到，而且葡萄酒里有很 多泡沫。5疑似菌落的观察：观察上次疑似菌种培养基的培养结果，发现效果还是不佳，虽然 有很少的的黑色霉菌生长，但是通过显微镜观察，发现，它应该是霉菌的一种，而不是酵母菌备份培养基的观察：有意外的收获，发

14、现，备份的六个培养基，酵母菌生长的都很 好,有很多的乳白色的圆形斑点，湿润且光滑，闻起来有酒香味，且没有其他的杂菌，很 符合，酵母菌的菌落培养特征。且通过显微镜的观察，观察到了很清晰的酵母菌细 胞。对比分析:第一次培养的失败的原因：1、可能是刚一开始，葡萄汁中的酵母菌很少，而稀释的倍数太大，导致涂布培养 时，其他杂菌的数量优势甚于酵母菌，所以才会出现那样的结果。2、也有可能在超净工作台进行涂布操作时，没有严格做到无菌，培养基被污染。3、而备份成功的缘由是3-4天时，酵母菌生长旺盛，抑制了其他杂菌的生长，使 得生长出来的菌落，很纯净。（四第三次培养观察：（6-7天准备工作:PDA培养基的制备,麦

15、芽汁培养基的制备，培养皿的灭菌。将备份培养基中长出的酵母菌，进行涂布接种,在10-4、10-5、10-6三个稀释度, 每组做四个培养基（两个PDA,两个麦芽汁，做好后放入28度恒温的培养箱内进行培 养。观察:两天后取出观察,PDA培养基上菌落长势良好，10-4的两个培养基上菌落 数过多，无法计数，而10-5、10-6的培养基上，菌落分布均匀，可以计数。可能是由于涂布不均匀的问题，麦芽汁培养基上菌落，太过集中，没有PDA上生 长的好。由于时间的有限，我们将此组培养基的菌种接种到对照的葡萄酒中。由于7天左右已经是酒精发酵的后期，我们发现在空白的葡萄酒中，已经几乎看不到气泡，而 在对照的试验中，我们发现还有很多的泡沫，而且酒精味更浓。（五第二次发酵8-9天后,过滤进行第二次发酵，发现葡萄果肉大部分已变为酒，发酵基本完成，过 滤出的葡萄酒，颜色呈暗紫色,而且很浑浊。葡萄酒放入到第二次发酵罐中进行二次 发酵。二次发