金属离子对原花青素和牛血清白蛋白相互作用的影响

1、 学学 号号 0908014127 蛋白之间相互作用的影响蛋白之间相互作用的影响分分 类类 号号 密密 级级 10722 公开公开 Metal ion for the Procyanidins and for interaction between bovine serum 作者姓名作者姓名指导教师指导教师学科门类学科门类提交论文提交论文日期日期专业名称专业名称学校代码学校代码成绩评定成绩评定 化化 学学尚永辉尚永辉 2013 年年 5 月月 金属离子对原花青素与牛血清白金属离子对原花青素与牛血清白 张张 沛沛 理理 学学摘要-摘摘 要要采用荧光光谱法研究了不同温度下金属离子 Fe2+、Zn2

2、+对原花青素和牛血清白蛋白(BSA)之间相互作用的影响。实验结果表明，不存在金属离子时，原花青素对 BSA 的荧光猝灭过程为静态猝灭，在 Fe3+ 或 Zn2+的存在下，原花青素和牛血清白蛋白相互作用的峰逐渐降低，说明了这两种金属离子可以增大原花青素对 BSA 的猝灭，并且随着原花青素浓度的增加，猝灭的效果越明显。关键词关键词：金属离子；荧光光谱；原花青素；牛血清白蛋白AbstractEffects of metal ions Fe2+, Zn2+ of proanthocyanidins and bovine serum albumin by fluorescence spectroscop

3、y at different temperatures (BSA) influence the interaction between. The experimental results show that, there is no metal ion, fluorescence quenching process of proanthocyanidins on BSA is a static quenching procedure in Fe3+ or the presence of Zn2+, the interaction of proanthocyanidins and bovine

4、serum albumin was gradually reduced, and show that the two kinds of metal ions can increase the procyanidins quenching of BSA, and with the increase of proanthocyanidins concentration quenching effect more obvious.Key words: Metal ion; fluorescence spectrophotometry; procyanidins; bovine serum album

5、in目目 录录摘摘 要要.I目目 录录.前前 言言.11 文献综述文献综述.21.1 原花青素.21.2 牛血清白蛋白.31.3 药物小分子与大分子的相互作用的研究现状.31.3.1 药物小分子与大分子的相互作用模式.31.3.2 分析方法及进展.42 实验部分实验部分.72.1 药品试剂与仪器设备.72.1.1 药品试剂.72.1.2 仪器设备.72.2 实验步骤.73 结果与讨论结果与讨论.83.1 白杨素对 BSA 的猝灭作用 .83.1.1 猝灭光谱.83.1.2 测定结合常数以及猝灭机理.83.1.3 研究作用力类型及热力学性质.93.2 Fe2+对原花青素与 BSA 的相互作用的影

6、响3.2.1 荧光猝灭光谱图.103.2.2 同步荧光光谱.10 3.3 Zn2+对原花青素与 BSA 的相互作用的影响.11 3.3.1 荧光猝灭光谱法.12 3.3.2 同步荧光光谱.133.4结结 论论.14致致 谢谢.15参考文献参考文献.160前前 言言从上世纪90年代以来，DNA、蛋白质和药物小分子的研究已经成为化学以及生命科学的热门主题之一。并且在分子水平来探究这些小分子、大分子、离子，尤其是药物分子之间的相互作用，是当前医学、化学、生物科学以及临床医学等很多领域的重要的研究课题，并且引起了很多学者的关注。人类和药物是密切相连，经过长期反复的实验与实践，历史上人们也发现了许多可以

7、治疗疾病的药物。但随着科技的发展，药物的效率必须提高，而副作用必须减小，为了达到这一目标，人们开始了一系列的模拟疾病的过程或者效果的体外和体内的系统，用这些来挑选来自植物和动物以及微生物发酵和人工合成的各个化合物。伴随着医学、生物学和化学的发展以及人们对病症的发生、发展的深入了解，这些选择出来的系统也从简单的动植物模型逐渐转变为专门针对病症治疗靶点命中率更好的选择体系。比如蛋白质，蛋白质则是生物体内重要的大分子，它可以运载、储存生物体内的一些物质，主要由于它的特殊结构，使其在生物体内有着很关键的作用。对于蛋白质当中的血清蛋白来说，它是非常丰富的载体蛋白在血浆内，药物一旦进人血浆内，就会立即先于

8、血清蛋白合成，然后再通过血清蛋白运送到身体的每个部位，从而达到发挥药效的作用。这也是从分子的水平上来研究血清白蛋白和小分子之间的相互作用，对于了解药物的转运和代谢的过程，都非常有帮助，并且可以为具有高活性的药物小分子设计和开发研究出有价值的一些信息。对于原花青素的来说，它是迄今为止所发现最好的天然的抗氧化剂，并且它还具有防癌、抗癌、抗高糖、抗辐射，调节免疫力，保护皮肤等等一系列对人体有益的作用，它分布在较多的植物中，具有很强的药理性。所以，研究原花青素和白蛋白是现如今国内外的热点话题。它可以为人类的克服疾病方面做出很大的贡献。近些年，人们采用了非常丰富的手段研究药物小分子、DNA 以及蛋白质之

9、间的相互作用，以及当有金属离子存在时，对他们实验结果的影响程度。目前常用到的方法有许多，比如说：紫外可见吸收光谱法、荧光光谱法、元二色谱法、线二光谱法、傅里叶转换红外光谱法、拉曼光谱法、核磁共振等等一系列的方法。而荧光光谱法则是目前研究蛋白质与各种有机小分子、离子或无机化合物之间相互作用的重要手段之一。金属离子对原花青素与牛血清白蛋白相互作用的影响- 1 - 1 文献综述文献综述 研究金属离子对原花青素和 BSA 之间相互作用的影响为研究金属离子对于药物小分子和生物大分子（牛血清白蛋白、核酸）之间的作用的影响的发展起到很大的作用.在机体是由数以亿万计分子量大小不等的分子组成。蛋白质是体内重要的

10、生物大分子。蛋白质担负着各种生理功能，是生物性状的直接表达者。它在人体代谢中扮演极为重要的角色，从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行，人类绝大多数疾病都是由蛋白质异常引起的。因此核蛋白质的分析在生命科学、生化药物、食品分析及临床检验中都有着重要作用。深入研究小分子物质与蛋白的作用，对分子水平上阐明生命的奥秘、开发新型药物、攻克许多疑难病症以及促进信息科学的发展都具有重要的意义，并且,生物体内存在很多种金属元素, 它们参与着多种重要的生命机体活动,任何一种生物所体必需的金属元素在体内含量过高或过低，都可能导致病态。金属离子本身也可与药物分子或者生物大分子相互结合。因此,研究药物小分子、金属离子与

11、生物大分子之间的相互作用对于指导药物设计与合成、认识并了解某些疾病的致病机制和药物治病机制、明确生物大分子的结构和功能、探索超分子体系的化学本质等都有着重要的意义.并因此成为医学、药学、生物学、计算化学及物理学等领域的研究的热点, 是生命科学研究非常重要的组成部分。 国外的许多研究学者在很早之前就做了金属离子与血清蛋白之间的相互作用。国内对金属离子和血清蛋白的研究则相对较晚，大概 80 年代初期开始起步，但也取得了一些比较有意义的成果。国内外在此领域研究的目的在于全面了解药物的作用机理和它的不良反应,对传统药物的预估和对新药物的开发和研究。此领域研究的方法很多,范围比较广泛,比如光谱法、色谱法

12、、电泳法、电化学方法以及其他物理化学方法等。尤其是光谱法的研究，并取得了一定的研究成果，为促进药物的生产提供了一定生产工艺。目前,有关金属离子对药物小分子和生物大分子之间作用影响的报道非常的多。本文拟采用荧光光谱法研究不同温度下不同的金属离子对它们之间相互作用的影响以及影响的程度, 拟根据实验所得数据对它们的相互作用机理做初步的研究与探讨。1.1 原花青素原花青素原花青素,简称 OPC。分子式及分子量:C30H26O13 594.5, 红棕色粉末，沸点 986.4Cat760mmHg, 气微、味涩，能溶于水和大多数有机溶剂。是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮，是目前国际上公认的清除人体内自由基

13、最有效的天然抗氧化剂。最新研究表明蓝莓叶提取物原花青素可阻止丙肝病毒复制。结构式如下：2 1.2 牛血清白蛋白牛血清白蛋白牛血清白蛋白(Bovine albumin)，又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa。等电点为4.7。储存条件，2-8C。溶解度40 毫克/毫升。其主要成分有：蛋白质、多肽、激素以及其他成分。它是以牛血为原料分离出血清，用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得。 生产用途： 1、 用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用于医药保健食品、调味品 3、维持渗透压、PH 缓冲、载体作用 4、在 PCR 体系中有助于 Taq 酶稳定

14、性及活性可以提高 PCR 的效率 BSA 的作用: BSA 一般做为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活性低。加入 BSA 后，它可能起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加 BSA 后能使其活性大幅度提高。不需要加 BSA 的酶加入 BSA 一般不会受到什么影响。对多数底物 DNA 而言，BSA 可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37，酶切反应超过1h 时，BSA 可以使酶更加稳定，因为在不含 BSA 的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37下只能存活1020min 甚至更短的时间。而 BSA 可以结合缓冲液或底物DNA 中抑制限制性内切酶活性的

15、金属离子和其它化学物质。三维结构图如下： 1.3 药物小分子与大分子的相互作用的研究现状药物小分子与大分子的相互作用的研究现状1.3.1 药物小分子与大分子的相互作用模式药物小分子与大分子的相互作用模式 药物小分子和DNA之间的相互作用主要是非共价键结合、共价键的结合以及三种剪金属离子对原花青素与牛血清白蛋白相互作用的影响- 3 -切模式。非共价键的结合又被分成静电结合、沟槽的结合以及嵌结合等三种模式。小分子作用DNA的双螺旋结构外表面是静电结合,并且没有选择性。分子和DNA大沟或者小沟的某些碱基对的直接作用是沟槽结合，且药物小分子往往在小沟中作用。嵌结合则是将小分子内的平面直接嵌入到核酸的一

16、些碱基之间。这也是小分子和DNA作用的重要方法之一。当药物小分子和靶部位的大分子结合后，会使大分子发生如构象的变化等变化，然后会引起一些列的生物、化学、物理变化，最后表现在性质以及各个功能的变化。因此，药物的效应简单的可以理解成机体自身对药物小分子和生物大分子之间的相互作用整体反应。药物分子和牛血清白蛋白之间的作用力有静电力、范德华力、氢键、疏水作用力等等。 与血清白蛋白结合的一些共存物质是会影响药物小分子和生物大分子的结合。生物体内的许多微量元素也参加了很多重要的生命活动，Fe3+、Zn2+、Mg2+等，都和生物的生存息息相关。所以研究这些对无机离子在生物体内的生理、生化作用，还有他们对各物

17、质之间的体内的代谢过程的影响都具有很重要的意义。1.3.2 分析方法及进展分析方法及进展根据利用不同的参数表征情况，此领域的研究包括了光谱法、色谱法、电泳法、电化学和其他的各种理化方法。在光谱法中主要的方法有紫外-可见吸收光谱法(UV-vis absorption spectroscopy)、荧光光谱法(fluorescent spectrum)、圆二色谱法(circular dichroism，CD)、拉曼光谱法(Raman spectroscopy)等等。然则蛋白质分子中的某些氨基酸具有一些特别的光学活性，在270nm附近有吸收，对于许多药物自身也有光学活性，药物分子也可以和蛋白质结合产生

18、了光学活性或者改变了原来的光学活性。因此，应用光谱法来研究药物小分子和生物大分子的结合机理是非常有效、非常便捷的方法。本文是对光谱分析法中的荧光光谱法进行介绍。荧光光谱法荧光光谱法 对于药物小分子和大分子之间相互作用来说，荧光光谱法是一种广泛应用且具有较多成果而且有效的一种重要的手段，它的特点是快速、灵敏度高、选择性好等特点。当有小分子和核酸发生嵌结合的时候，可以在荧光测定时看到由于该作用而发生的荧光猝灭表象。最早应用的荧光探针是溴化乙锭( EB)，现如今已经被广泛的应用于医学中的抗癌药物的选择和药物小分子和核酸的相互作用。溴化乙锭( EB)和DNA结合可以用Scatchard方程来加以描述，

19、,r/ c = k ( n - r)，用此公式作图，可以根据斜率和截距的变化判断药物小分子和DNA之间的作用。而在蛋白质中有具有內源荧光的的色氨酸、络氨酸，并且在340nm处有最大的荧光峰。再有药物加入的同时，BSA的荧光强度呈有规律的变化，这就可以说明药物对荧光有猝灭的作用。荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭，可以根据上面的公式求得猝灭曲线，却定猝灭的类型。并根据他们的焓变、熵变来找出他们之间的作用力。张勇等利用了荧光猝灭的方法探究了金属离子、丝裂霉素与血清白蛋白之间的相互作用以及影响，并且计算了丝裂霉素与血清白蛋白之间的结合常数。Fe3+、Zn2+、Mg2+等离子可以是结合常数发生降低，而Cu

20、2+则增大。4高旭等在模拟动物的生理条件下，采用荧光猝灭的方法研究了（BSA）和铬之间的相互作用，发现铬对BSA有相对较强的猝灭作用。并通过对数据的研究和处理，发现了铬和BSA之间是静态的荧光猝灭，并且测定了他们的猝灭常数，确定了结合位点数是2。 Silva也研究了氯丙嗪与氯高铁红素和牛血清白蛋白的相互作用，实验结果表明了氯高铁红素能增强氯丙嗪对的牛血清白蛋白的猝灭作用，使BSA的构象发生了变化。金属离子对原花青素与牛血清白蛋白相互作用的影响- 5 - 2 实验部分实验部分2.1 药品试剂与仪器药品试剂与仪器设备设备2.1.1 药品试剂药品试剂牛血清白蛋白(BSA，Sigma 公司，相对分子质

21、量：68000） ；pH 值为 7.4 的 Tris-HCl缓冲溶液；用 0.1molL-1pH=7.4Tris-HCl 缓冲溶液配成浓度为 110-4molL-1 的溶液 BSA溶液；110-3mol/L 的原花青素溶液，0.110-3molL-1 的 ZnCl2、FeCl3溶液。实验用水均为二次去离子水。2.1.2 仪器仪器设备设备RF-5301 型荧光分光光度计（日本岛津公司)；HA-180MF 电子分析天平（日本日立公司） ；TB-85 型恒温水浴（日本岛津公司） ；pHSJ-4ApH 计（上海雷磁仪器厂） 。2.2 实验步骤实验步骤称取 1.211gTris 溶解配置成 100ml

22、0.1ml/L 的溶液；称取 0.0406g FeCl3溶解，配置成250ml 110-3ml/L 的溶液；称取 0.1395ZnCl2溶解，配置成 250ml 的溶液，再取其中的25ml 稀释至 250ml 得约 110-3mol/LZnCl2 溶液，取 0.1mol/lTris 溶液 50ml，加 0.1mol/L 盐酸 48.0ml, 混匀加水稀释至 100ml 得到的溶液为 pH=7.4Tris-HCl 缓冲溶液。取 18 个10ml 的比色管对其进行编号，分别向所有试管中加入一定量的 1.010-4mol/LBSA，然后每 3 个试管为一组，给每一组中的 3 个试管分别加入一定量 1

23、.010-3mol/L 的原花青素，然后在试管中分别加入一定量 1.010-3mol/LFeCl3 （或 ZnCl2），最后向每一个试管中加入 3ml PH 值为 7.40 的 Tris-HCl 缓冲溶液，用蒸馏水定容到 10ml，静置 30min。在室温（295K）下，用荧光分光光度计在波长 300700nm 范围内进行扫描发射光谱，同时在波长 235700nm 和 280700nm 范围内分别做同步荧光，然后分别在三种不同的温度下扫描发射光谱，绘制出一系光谱图。6 3 结果与讨论结果与讨论3.1 原花青素对原花青素对 BSA 的猝灭作用的猝灭作用3.1.1 猝灭光谱猝灭光谱按照上面所述的试

24、验方法分别研究了 296 K、301K、305K 的温度下，在不同浓度下原花青素对 BSA 的荧光猝灭光谱。图 1 是 296K 时的猝灭光谱。从图 1 可以看到, 随着原花青素浓度的逐渐增加 BSA 的吸收峰逐渐降低。这是因为牛血清蛋白质中有酪氨酸和色氨酸， 使的蛋白质具有内源荧光，令 BSA 的量固定不变，使原花青素的浓度逐渐增加时， BSA 与原花青素的相互作用会使 BSA 内源荧光强度产生有规律的猝灭现象。 300350400450500020406080100120140160FWavelength/nm04图图 1 296K 原花青素与原花青素与 BSA 相互作用的荧光猝灭光谱图相

25、互作用的荧光猝灭光谱图3.1.2 测定结合常数以及猝灭机理测定结合常数以及猝灭机理 BSA 的荧光猝灭有动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程，使激发态分子返回基态的过程。动态猝灭过程遵 Stern-Volmer 方程：F0/F=1+KSVQ=1+Kqt0Q式中，F0 和 F 分别是不存在和存在猝灭剂时蛋白质的荧光强度，Q是猝灭剂的平衡浓度，KSV 是 Stern-Volmer 猝灭常数 Kq 为双分子猝灭速率常数，t0 是在没有猝灭剂存在的情况下测的光寿命。根据猝灭剂存在时的荧光寿命和不存在时的荧光寿命不同，Stern-Volmer 方程式的另一种表

26、达形式为：t0/t=1+KSVQt0 和 t 分别表示没有猝灭剂存在所测得的荧光寿命与有猝灭剂存在下所测得的荧光寿命。静态猝灭与动态猝灭所得的关系式相似，只是在静态猝灭的情况下用络合物形成常数代金属离子对原花青素与牛血清白蛋白相互作用的影响- 7 -替猝灭常数。0.00.51.01.52.02.53.03.50.00.20.40.60.81.0QF0/F-144度35度25度15度相关数据如表 1 所示：表表 1 不同温度下白杨素对不同温度下白杨素对 BSA 的猝灭方程及猝灭常数的猝灭方程及猝灭常数温度/KStern-Volmer 方程Kq(1013Lmol-1s-1)295F0/F-1= 0

27、.301Q + 0.00610.301303F0/F-1=0.2848Q - 0.00120.2848310F0/F-1=0.2468Q + 0.00450.2468317F0/F-1=0.2078Q - 0.0088 0.20783.1.3 研究作用力类型及热力学性质研究作用力类型及热力学性质分子间作用力有静电引力、疏水作用力、氢键、范德华力等，温度变化幅度微小时H 可看做是不变的，利用热力学公式计算出 H、S、G 计算结果在表 1 中。由 G0 可知原花青素与 BSA 的相互作用是自发完成的，又由于 H0 且 S0，可以推断出原花青素与 BSA之间相互作用主要以静电引力为主，但是由于原花青

28、素是多羟基疏水化合物，所以应该还有疏水作用力和氢键的存在。同步荧光光谱：8 250275300325350020406080FWavelength/nm04a300350400020406080100120140160FWavelength/nm04b图图 2 296K 原花青素与原花青素与 BSA 相互作用不同波长的的同步荧光光谱图相互作用不同波长的的同步荧光光谱图3.2 Fe3+对原花青素与对原花青素与 BSA 的相互作用的影响的相互作用的影响3.2.1 荧光猝灭光谱图荧光猝灭光谱图 1.金属金属 Fe3+对对 BSA 的猝灭图谱的猝灭图谱 300350400450500020406080

29、100120140160FWavelength/nm02250275300325350020406080FWavelength/nm02a300350400020406080100120140160FWavelength/nm02b 图图 3 296K 铁对铁对 BSA 的荧光猝灭图的荧光猝灭图从图 3 可以看出，296K 时，金属 Fe3+离子的加入使得 BSA 的峰逐渐呈降低的状态，所以说对 BSA 有明显的荧光猝灭。 2.铁对原花青素与铁对原花青素与 BSA 相互作用的影响的猝灭图谱相互作用的影响的猝灭图谱 金属离子对原花青素与牛血清白蛋白相互作用的影响- 9 - 30035040045

30、0500020406080100120140160FWavelength/nm03图图 4 301KFe3+对原花青素与对原花青素与 BSA 相互作用的荧光猝灭光谱图相互作用的荧光猝灭光谱图 图 4 从上到下依次为：a.BSA b.BSA+原花青素 c.BSA+原花青素+Fe3+ （2ml） d.BSA+原花青素+Fe3+（4ml） 根据设计的实验方法研究了在一定温度下，有 Fe3+参与时在不同浓度下原花青素对BSA 的荧光猝灭光谱。从上图 3 可以看到, Fe3使 BSA 的峰降低，所以 Fe3+对 BSA 有荧光猝灭的作用。图 4 是 301K 时的猝灭光谱。由图 4 中的线条 a、b 可

31、知，原花青素会使BSA 发生猝灭作用；由线条 b、c 可知，当有金属 Fe3原花青素与 BSA 相互作用的峰会变低，说明 Fe3+会增加原花青素对 BSA 的猝灭，而且随着原花青素浓度增加猝灭越明显；由线条 c、d 可知，当金属 Fe3+的浓度增大时，Fe3+对原花青素和 BSA 相互作用的峰变化不大，所以金属离子对体系的影响与它的浓度大小没有关系。由图可得，Fe3+、原花青素与 BSA 之间形成了三元配合物，从而产生了荧光猝灭，金属的加入导致猝灭程度加强。3.2.2 同步荧光光谱同步荧光光谱 250275300325350020406080FWavelength/nm04a300350400

32、020406080100120140160FWavelength/nm03b10 图图 5 301KFe3+对原花青素与对原花青素与 BSA 相互作用的影响的同步荧光光谱图相互作用的影响的同步荧光光谱图 由图可以看出，金属 Fe3+使原花青素和 BSA 之间的猝灭程度加深。 金属离子对原花青素与牛血清白蛋白相互作用的影响- 11 -结结 论论随着白杨素浓度的逐渐增加 BSA 的吸收峰逐渐降低。这是因为牛血清蛋白质中有酪氨酸和色氨酸，使的蛋白质具有内源荧光，令 BSA 的量固定不变，使白杨素的浓度逐渐增加时，BSA 与白杨素的相互作用会使 BSA 内源荧光强度产生有规律的猝灭现象。白杨素与 BS

33、A 之间相互作用主要以静电引力为主，但是由于白杨素是多羟基疏水化合物，所以应该还有疏水作用力和氢键的存在。从图 2 可以看到，Cu 2+对 BSA 的峰基本没有影响，所以 Cu 2+对 BSA 没有荧光猝灭，由图 3、图 4、图 5 可知，当有 Mn2+存在时白杨素与 BSA 相互作用的峰逐渐降低，说明Mn2+会加重白杨素对 BSA 的猝灭，而且随着白杨素浓度增加猝灭越明显。金属的加入导致猝灭程度加强，Mn2+、白杨素与 BSA 之间形成了三元配合物，从而产生了荧光猝灭。 12致致 谢谢今年是忙碌的一年，充实的一年，经过这半个学期的不懈努力，我的毕业设计也将要圆满完成了。将近两个月的实验经历，

34、是我在大学四年里对实验技能的总结与实验能力的提升，期间我得到了老师与同学的帮助，在此我要感谢我的指导老师尚永辉老师，以及我的同学刘丽同学，是你们的帮助我才能顺利完成这次毕业设计。在此向尚永辉老师表示诚挚的感谢和崇高的敬意。本人的毕业论文的实验工作大部分是在学校实验室里完成的，尚老师对于我的大部分实验细心指导，在论文的撰写也给予了莫大的帮助，他认真的科研态度，教会了我对待科研的正确态度。尚老师和蔼、勤恳、工作积极认真的态度使我终生受益匪浅。四年的大学生活给我留下的不仅仅是学术领域的进步，更多的是美好的回忆。最后，感谢各位老师对我的论文的批阅和指正。金属离子对原花青素与牛血清白蛋白相互作用的影响- 13 -参考文参考文献献1 卢继新, 李惠芬, 蔡乐等. 药物小分子与生物大分子相互作用的研究方法进展J. 分析