果蝇杂交实验 山东大学

1、 山东大学实验报告 2014年 5 月8日科目 遗传学实验 题目 果蝇杂交实验 果蝇杂交实验摘要 果蝇（Drosophila）是遗传学实验中最常用的动物之一。因为果蝇染色体数目少、生活史短、繁殖率高、饲养简便，在基因分离、连锁、交换等方面有着深入的研究。本次实验通过设计杂交实验，观察记录实验过程中的性状和数据，运用统计学相关知识分析实验数据，并验证分离定律、自由组合定律、连锁交换定律和伴性遗传。1. 引言普通果蝇的生活史历经卵，幼虫，蛹和成虫四个阶段，是一个完全变态过程。果蝇具有生活史短，突变型多，染色体数目少（2n=8）,繁殖率高，饲养简便等特点，是进行遗传学研究的好材料。普通果蝇突变型中，

2、有常染色体的残翅及伴性遗传的白眼等容易观察到的性状，便于实验分析。实验中选用的果蝇突变性状一般都可用肉眼鉴定，例如红眼与白眼，正常翅与残翅等。而另一些性状可在解剖镜下鉴定，如焦刚毛与直刚毛等。列表如下： 表一：本次杂交实验中使用的果蝇突变品系影响部分突变名称基因符号染色体上的座位翅残翅vgIIR 67.0眼色白眼wX 1.5体色黑檀体bIIR 48.5刚毛卷刚毛snX 21.0翅型小翅mX 36.1（卷刚毛的基因符号为sn3，报告中简写为sn。）分离定律：在生物的体细胞中，控制同一性状的遗传因子成对存在，不相融合；在形成配子时，成对的

3、遗传因子发生分离，分离后的遗传因子分别进入不同的配子中，随配子遗传给后代的现象叫做孟德尔分离定律。理论上配子分离比是11，F2代基因型分离比是121，若显性完全，F2代表型分离比是31 。野生型果蝇为红眼、灰身、长翅、直刚毛，与这些性状对应的突变性状很多，其中灰身（+）与黑身（b）是一对相对性状，且灰身对黑身为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上。用具有这对相对性状的两纯合亲本杂交，性状的遗传行为应符合分离定律。自由组合定律：当具有两对（或更多对）相对性状的亲本进行杂交，在子一代产生配子时，在等位基因分离的同时，非同源染色体上的基因表现为自由组合。实质上就是不同相对性状的等位基因

4、在配子形成过程中，等位基因间的分离和组合是互不干扰，各自独立分配到配子中去，它们所决定的两对相对性状在F2代是自由组合的，在杂种第二代表型分离比就呈9331。黑体果蝇的体色为黑色（b），与之相对应的野生型果蝇的体色为灰色（+），灰色对黑色为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上；果蝇另一突变性状为焦刚毛（sn），与之对应的野生型性状为直刚毛（+），控制这对相对性状的基因位于第一号染色体上，直刚毛对焦刚毛为完全显性。用具有这两对相对性状的纯合亲本杂交，其性状的遗传行为应符合自由组合定律。伴性遗传：位于性染色体上的基因，其传递方式与位于常染色体上的基因不同，它的传递方式与雌雄性别有关，

5、因此称为伴性遗传。生物某些性状的遗传常与性别联系在一起，这种现象称为伴性遗传（sex-linked inheritance），这是由于支配某些性状的基因位于性染色体上。果蝇属XY型生物，共有四对染色体，第一对为性染色体，其余三对为常染色体。雌果蝇的性染色体构型为XX，、雄果蝇为XY。控制果蝇眼色的基因位于X染色体上，在Y染色体则没有与之相应的等位基因。将红眼（+）果蝇和白眼（w）果蝇杂交，其后代眼色的表现与性别有关。而且，正反交的结果不同。连锁交换定律：连锁是指在同一同源染色体上的非等位基因连在一起而遗传的现象；互换是指同源染色体的非姊妹染色单体之间的对应片段的交换，从而引起相应基因

6、间的交换与重组。同一条染色体上的基因是连锁的，而同源染色体基因之间可以发生一定频度的交换，因此在子代中将发现一定频度的重组型，但一般比亲组型少得多。基因的连锁交换定律(linkage and cross-over law)是遗传学的三大基本规律之一，描述了位于同一染色体上的基因的遗传呈现连锁现象，而同源染色体上的非等位基因之间又存在一定的交换现象。果蝇的翅膀是一种分析器官大小、形状和发育格局的良好的分析系统。许多基因参与了翅的发育调控，新的遗传控制机理还在发现和不断研究中，重要基因的突变或相互作用可能导致功能变异及翅型变化。果蝇的白眼、小翅、卷刚毛(w、m、sn)这3对基因都位于x染色体上，它

7、们之间也呈现一定的连锁互换现象。2. 材料和方法2.1 实验材料材料：不同品系的果蝇18号：野生型果蝇：红眼、灰身、长翅、直刚毛（+ + + +）14号：黑残果蝇：黑檀体、残翅（ee vgvg）品系； 6号：三隐果蝇：灰身、白眼、小翅、卷刚毛（+ w m sn/+ w m sn）。（其中，白眼、小翅和卷刚毛性状均位于X染色体上）培养瓶，麻醉瓶，白色塑料板，小毛笔，油性记号笔； 麻醉剂：乙醚。2.2 实验方法2.2.1 第一周（3月21日/28日）设计实验：我们组实验目的是验证自由组合定律与连锁交换定律，所以我们要选取不同品系的果蝇进行杂交实验。14号果蝇（黑檀体、残翅）和18号野生型

8、果蝇（灰身、长翅）杂交用于验证自由组合定律；6号果蝇（白眼、小翅、卷刚毛）和18号野生型果蝇（红眼、长翅、直刚毛）杂交用于验证伴性遗传和连锁交换定律。表二：亲本果蝇类型项目自由组合定律基因的连锁与交换亲本18号（灰身，长翅）18号（红眼、长翅、直刚毛）14号（檀黑体、残翅）6号（白眼、小翅、焦刚毛）收集处女蝇：在做杂交实验6-8小时前，选择生长较好、含蛹较多的培养瓶，将瓶中的所有成蝇都清除。8小时内，瓶中生长出的雌蝇均尚未发生交配，为我们所需的处女蝇。接种：按照设计实验的正交和反交方式，将处理好的雌雄果蝇分出性别并确认性状正确后，每个培养瓶中接种2-3只不同性别的果蝇，贴好标签和记号，写明杂交

9、组合和姓名。置于室温培养。2.2.2 第二周（3月28日/4月4日）培养瓶中的亲本蝇已培养7天，为避免混淆，在F1孵出前将亲本蝇倒出。2.2.3 第三周（4月4日/4月11日）杂交亲本之后的第11-12天，F1开始出现。观察并记录F1代的性状，如果没有出现预期外的性状，则可以选取3-4对F1子蝇接入新的培养瓶中，置于室温下培养。2.2.4 第四周（4月11日/4月18日） 在F2代成虫出来之前，为避免亲子蝇混淆，要倒出培养瓶中所有的F1果蝇。2.2.5 第五周及第六周（4月14日23日/4月21日30日）接种F110天之后，F2代子蝇出现，在出现后的10天之内，每间隔2-3天统计并记录瓶中F2

10、代果蝇的性状和数目，以及相应雌雄比例。2.2.6 数据分析对自己组统计的实验数据分析并且对杂交实验的结果进行2测验，对比实验值和期望值。3. 结果3.1实验数据及分析3.1.1自由组合定律表三：果蝇18号与14号的杂交结果正交（雌18号×雄14号）反交（雌14号×雄18号）F1表型灰身长翅 表型灰身长翅雌雄雌雄数目1623数目93F2表型灰身长翅灰身残翅黑身长翅黑身残翅表型灰身长翅灰身残翅黑身长翅黑身残翅数目198585312数目627164比例49.514.513.253比例15.51.75413.1.1.1图谱18号 灰身长翅（AABB） 14号 黑檀体残翅（aabb）

11、【正反交相同】P: AABB（灰身长翅）×aabb（黑檀体残翅） F1: AaBb(灰身长翅)自交F2：AABB AaBB AABb AaBb aaBB aaBb AAbb Aabb aabb灰身长翅 黑檀体长翅 灰身残翅 黑檀体残翅理论 比值： 9 ： 3 ： 3 ： 1实际 正交 数量： 198 5 4 1 比值： 49.5 ： 14.5 ： 13.25 ： 4 反交 数量： 62 7 16 4 比值： 15.5 ： 1.75 ： 4 ： 13.1.1.2 适合度检验我们通过卡方检验来判断实际结果与预期结果是否符合。体色基因和翅型基因是在不同的染色体上的，他们在遵循自由组合定律的

12、同时，各自又遵循分离定律。于是我们通过对单对性状的结果进行适合度检验来验证分离定律，对两对性状的结果进行适合度检验来验证自由组合定律。检验结果如下：表四：18号果蝇与14号果蝇杂交的单因子适合度检验正交基因体色基因（A/a）翅型基因（B/b）表型灰身檀黑合计长翅残翅合计观察值（O）2566532125170321预期值（E）240.7580.25321240.7580.25321（O-E）2/E0.9662.8983.8640.4361.3091.74523.8641.745P（n=1）0.02-0.05(<0.05)0.1-0.25(>0.05)反交基因体色基因（A/a）翅型基因

13、（B/b）表型灰身檀黑合计长翅残翅合计观察值（O）692089781189预期值（E）66.7522.258966.7522.2589（O-E）2/E0.0760.2280.2951.8965.6887.58420.2957.584P（n=1）0.10-0.50（>0.05）<0.01表五：18号果蝇与14号果蝇杂交的双因子适合度测验表型合计正交灰身长翅檀黑长翅灰身残翅檀黑残翅观察值（O）198585312321预期值（E）180.5660.1960.1920.06321（O-E）2/E1.680.080.860.403.0223.02P（n=3）0.25-0.50(>0.0

14、5)反交观察值（O）62716489预期值（E）50.0616.6916.695.5689（O-E）2/E2.855.630.030.448.9528.95P(n=3)0.02-0.05（<0.05）3.1.1.3数据分析适合度检验的结果表明：单对性状检验中，体色基因的正交结果不在分离定律的随机误差范围内，反交结果符合；翅型基因的正交结果在分离定律随机误差范围内，反交结果不符合。两对性状检验中，正交结果在自由组合定律随机误差范围内，反交结果不符合。对于这种正反交始终一种符合一种不符合的验证结果，结合产生的后代数量来看，我们提出了这样的猜想：是否是不同基因在雌雄配子中的存活率不同，使其在正

15、交与反交时产生了差异，导致后代的数量有明显不同，从而使检测结果出现异常。我们查阅了相关的文献1，发现有人做过对中国春与粗山羊草的正反交授粉后不同时间固定的子房的胚胎学研究，结果出现了正交所形成的正常胚的质量比反交形成的胚质量要好；而在反交组合中,受精发育过程较正常,而在正交组合中受精过程延迟,多数受精卵败育的情况。另外在之前别人做的果蝇杂交实验中他们有提出：残翅突变比黑檀体突变对果蝇生存的影响更大。那么就可能是残翅降低了果蝇的生存能力，使残翅果蝇存活率低。这些也只是对于我们猜想的一个例证，目前没有具体证明相关结论。 另外，我们认为反交实验做的组数比正交要少也存在关系。由于在反交组的F1代果蝇在

16、接入新的培养瓶的过程中出现了死亡，导致其后代的数目要远远少于正交组。F1代数量上的差异可能是导致F2代出现结果一边倒的原因。3.1.2连锁交换定律表六：果蝇18号与6号杂交结果F1（1）正交（雌18号×雄6号）反交（雌6号×雄18号）F1表型红长直 白小卷 表型红长直白小卷雌雄雌雄雌雄雌雄数目131700数目160113比例3.254.25/比例4/0.253.25如表中蓝色数字所示，F1代中不应该出现性状为白眼小翅卷刚毛的雌性果蝇。通过小组人员和老师讨论，一致认为三种性状都发生了改变，因此基本不存在变异的可能性。最可能的原因是在接入亲本时没有仔细看清楚性状，将性状为白眼小

17、翅卷刚毛的雄性果蝇误认为是白眼小翅卷刚毛的雌性果蝇接入了培养瓶中，产出的F1代中便存在白眼小翅卷刚毛的雌性果蝇。至于该性状的果蝇数量如此少，我认为可能是因为F1代果蝇获得的数量过少。因此，该组果蝇应当被舍弃，无法进行后续自交来验证实验。我们采用了另一小组的性状正常的果蝇的反交F1代，进行后续的自交实验。表七：果蝇18号与6号杂交结果F2（2）F2表现型正交（雌18号×雄6号）反交（雌14号×雄18号）雌性雄性合计雌性雄性合计红长直（+ + +）11544159292352白小卷（w m sn）0242420929白小直（w m +）022000红长卷（+ + sn）0000

18、00红小直（+ m +）12820257白长卷（w + sn）011314白长直（w + +）044134红小卷（+ m sn）033000合计12786213554196表八：果蝇18号与6号杂交反交结果【全班】（3）F2 表型1组2组3组4组5组6组7组合计比例红长直（+ + +）1425212520232415274.912%白小卷（w m sn）9588891360白小直（w m +）000000001.413%红长卷（+ + sn）10003004红小直（+ m +）612088103514.488%白长卷（w + sn）20110116白长直（w + +）1313133159.18

19、7%红小卷（+ m sn）114010411合计34353737414455283100%3.1.2.1图谱P: 红长直（+ + +/Y） × 白小卷（w m sn/ w m sn）F1： 白小卷（w m sn/Y） × 红长直（+ + +/ w m sn）F2: 红长直（+ + +） 白小卷（w m sn） 白小直（w m +） 红长卷（+ + sn）红小直（+ m +） 白长卷（w + sn） 白长直（w + +） 红小卷（+ m sn）3.1.2.2结果分析正交的F1代中雄性果蝇和雌性果蝇均为红长直，无法进行三点测交实验计算重组率。而反交的F1代中雄性果蝇均为三隐性，

20、雌性均为显性，可以用于三点测交重组率的计算。表九：三点测交结果表现型数量红长直（+ + +）52白小卷（w m sn）29白小直（w m +）0红长卷（+ + sn）0红小直（+ m +）7白长卷（w + sn）4白长直（w + +）4红小卷（+ m sn）0合计96通过观察反交的结果，我们发现白小直（w m +）和红长卷（+ + sn）两种果蝇数量为0，可以判断这两种性状是双交换结果。因此可知，刚毛性状基因位于三者的中间，三种基因在染色体上的顺序为：m sn w。下一步为了确定三种基因在染色体上的图距，我们进行了重组值的计算。结果如下表：表十：重组值计算结果（1）本组实验理论值 重组值图距R

21、f（w-m）15.625%+0%*2=15.625%15.62534.6Rf（sn-m）4.167%4.16715.1Rf（w-sn）11.458%11.45819.5并发率0干扰1由Rf值可得sn-m间的图距是4.167cM，w-sn间的图距是11.458cM，因此三种基因在染色体上的排列顺序如下：m sn w4.167 11.45815.625理论连锁图：m sn w15.1 19.634.6和理论值相比，我们发现差距相当大，我们首先考虑可能是实验数据过少的原因。因此我们搜集了全班多组数据进行计算。结果如下：表十一：重组值计算结果（2）各组实验理论值重组值图距Rf（w-m）23.675%+

22、1.413%*2=%26.50134.6Rf（sn-m）10.601%10.60115.1Rf（w-sn）15.901%15.90119.5并发率0.838干扰0.162根据计算出的重组值绘制出连锁图：m sn w15.901 10.60126.501对比全班数据和我们一个组的数据，我们发现：随着果蝇数据样本的增多，最后的结果也越来越接近理论图距值，但是仍旧和理论值有一定的差距。综合分析，我认为存在差距的原因可能有：1、实验室中果蝇数目有限，这使引起的误差的影响力加大，也是导致结果与理论值有偏差的一大原因。2、性状判断时存在误判，在进行F2计数时经常不小心把果蝇给麻醉死了，在镜下观察翅型的时候

23、，看到的果蝇都是翻翅的，会存在长翅与小翅在观察过程中有误判的情况。而且有时候有的果蝇没有完全羽化，特征不是非常明显，也会导致误判。从而导致统计的数据存在一些问题而影响结果。3、在统计果蝇数据时，由于操作不当存在丢失或者是混淆果蝇的情况。4、三隐果蝇的个体生存能力较弱，在密度交高的幼虫群体中，容易死亡而被淘汰。因此可能会对实验误差有影响。5、果蝇的生活史与温度密切相关，但是由于本次实验是全班人一起做的。由于每组的实验设计时间不同，导致很多人做的时候把全班的果蝇取出来就没有再放回温箱中。做实验的时间持续了近一个月，温度不可能一直保持在25不变。所以温度对果蝇的生长可能有一定的影响。6、通过查阅文献

24、2，我们得知，在三隐性性状分析的三点测交实验中，F2代会变异产生一种新性状叫做小皱翅（如图2）。在我们组统计F2代果蝇的时候，确实有出现过这样的果蝇。但是由于我们不知道这种性状和小翅不一样，因此都把它当做了小翅来计算。在那篇文献中，研究者通过计算发现，如果将小皱翅忽略，则对最后的结果无显著性影响，但如果把小皱翅算作残翅或小翅，都会使结果产生显著性差异。4. 讨论4.1注意事项及改进之处：（1）由于是第一次养果蝇，我们在实验过程中导致许多果蝇死亡，甚至有的全管霉变或无子代产出。（2）观察果蝇的性状时，尽量用肉眼直接观察，不要长时间放到解剖镜下，会导致果蝇由于温度过高而被烤死。解剖镜可以作为辅助观察一些难以确定的性状。（3）果蝇的生活史与温度密切相关，每次计数操作完都应当把果蝇放回到恒温箱中培育。（4）果蝇要适度麻醉，挑蝇用毛笔，忌用镊子和其他工具，以免影响果蝇生长繁育。 （5）挑处女蝇时，每次只挑12小时内羽化成虫，超过12小时的成虫已逐渐有交配能力,必须一只不留地倒出处死,才能进行第二次挑选。 （6）刚羽化的果蝇色淡白，体软绵，难辨，务必小心区别。 （7）使用毛笔和塑料板，要用酒精棉球消毒，同时必须晾干才能使用。 （8