miR9b致胚胎心脏畸形的机制？

1、国家自然科学基金国家自然科学基金标书写作分析标书写作分析mir-19b致胚胎心脏畸形的机制研究致胚胎心脏畸形的机制研究思路与背景介绍思路与背景介绍v 心脏发育很重要心脏发育很重要v 从胎儿畸形心脏从胎儿畸形心脏-正常心脏中寻找研究线索正常心脏中寻找研究线索-差异差异mirnav mirna19b差异明显、生物信息学分析发现其在物种间功能保守差异明显、生物信息学分析发现其在物种间功能保守v 做实验发现：做实验发现： mirna19b过表达可以导致过表达可以导致斑马鱼心脏畸形（功能）斑马鱼心脏畸形（功能）v 读心脏发育文献：读心脏发育文献：影响影响wnt、bmp、tgfbeta是怀疑的可能机制（机

2、制）是怀疑的可能机制（机制）v 生物信息学分析发现：生物信息学分析发现： mirna19b下游靶标是下游靶标是wnt1v 临床标本确定：临床标本确定：wnt是变化的、与是变化的、与mirna19b关系是一致的关系是一致的v 提出问题提出问题：究竟是不是这个机制？：究竟是不是这个机制？（主线与研究内容）（主线与研究内容）mir-19b致胚胎心脏畸形的机制研究致胚胎心脏畸形的机制研究v 三个关键词：三个关键词： mir-19b 、先心、先心、wnt （mir-19b、心脏畸形、机制）、心脏畸形、机制）mir-19b致胚胎心脏畸形的机制研究致胚胎心脏畸形的机制研究确定有无创新确定有无创新v 源头创新

3、：源头创新： mir-19b与先心关系未见报道与先心关系未见报道v 切入点：切入点： mir-19b（主要论述点）（主要论述点）确定科学问题确定科学问题v 一个科学问题：一个科学问题： mir-19b致胚胎心脏畸形的机制？致胚胎心脏畸形的机制？v 一条主线：一条主线： wnt机制机制 （经典通路、研究的内容）（经典通路、研究的内容）提取关键词提取关键词1.mir-19b与先心关系：因果关系吗？与先心关系：因果关系吗？ 临床先心标本：临床先心标本： 发现发现mir-19b差异表达差异表达 斑马鱼实验：斑马鱼实验： mir-19b过表达出现心脏畸形过表达出现心脏畸形 缺乏：缺乏： mir-19b沉

4、默与表型之间的关系沉默与表型之间的关系2.wnt与先心关系：与先心关系：ok3.mir-19b与与wnt关系：怎样想到的？有证据吗？关系：怎样想到的？有证据吗？ 临床先心标本临床先心标本 mir-19b与与wnt表达变化的方向表达变化的方向 斑马鱼标本斑马鱼标本 mir-19b过表达时过表达时wnt通路变化通路变化 缺乏：缺乏： mir-19b沉默时沉默时wnt通路变化通路变化 mir-19b一定通过一定通过wnt通路作用吗？通路作用吗？ mir-19b与与wnt有直接结合位点吗？有直接结合位点吗？mir-19b wnt 先心先心？具体分析（画图）具体分析（画图）确定研究内容确定研究内容一条主

5、线下的三个层次一条主线下的三个层次 （一）整体验证（一）整体验证（mir-19b与心脏畸形）及与心脏畸形）及相关性评价（相关性评价（wnt）： mir-19b表达异常表达异常对斑马鱼胚胎心脏发育及对斑马鱼胚胎心脏发育及wnt信号通路的影响信号通路的影响 （二）机制分析：（二）机制分析：mirna-19b影响影响wnt信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制 1. mir-19b与与wnt1过表达过表达对斑马鱼心脏畸形的影响对斑马鱼心脏畸形的影响 2. mir-19b与与wnt1沉默表达沉默表达对斑马鱼心脏畸形的影响对斑马鱼心脏畸形的影响 （三）机制验证：（三）机制验证：

6、mir-19b对对wnt1的调控的调控机制机制 v 故事讲述：故事讲述：1）先心防治现状与危害）先心防治现状与危害 研究的必要性、意义研究的必要性、意义 2）目前有关遗传学研究进展）目前有关遗传学研究进展 国内外进展，提出国内外进展，提出mirna 3）有关）有关mirna与先心与先心 找到更新的会有价值找到更新的会有价值 4）mir-19b的发现的发现 与先心关系无，创新性与先心关系无，创新性 5）在斑马鱼的研究结果在斑马鱼的研究结果 整体功能指标整体功能指标 6）信息分析其可能机制信息分析其可能机制 wnt通路引出通路引出 7）临床标本临床标本+斑马鱼看斑马鱼看wnt通路通路 论证其机制的

7、可能性论证其机制的可能性 8）课题拟研究思路）课题拟研究思路 展现全貌展现全貌 9）研究成功将带来的价值）研究成功将带来的价值 研究价值研究价值写作策略写作策略标书初步写作标书初步写作摘要与立项依据部分摘要与立项依据部分(限限400字字)：mirnas 在胚胎心脏发育中发挥着重要的作用。前期应用下在胚胎心脏发育中发挥着重要的作用。前期应用下一代测序和一代测序和mirna芯片筛选均发现心脏畸形流产胎儿心脏组织中芯片筛选均发现心脏畸形流产胎儿心脏组织中mir-19b 表达异常，表达异常，mir-19b 过表达可致斑马鱼心脏发育畸形；生物信息学分析发过表达可致斑马鱼心脏发育畸形；生物信息学分析发现现

8、wnt1 为为mir-19b 的靶基因，在心脏畸形流产胎儿心脏组织中的靶基因，在心脏畸形流产胎儿心脏组织中wnt1 蛋白蛋白表达下调表达下调, wnt 信号通路下游蛋白信号通路下游蛋白gsk3表达上调，提示表达上调，提示mir-19b 可能通可能通过影响过影响wnt 信号通路致胚胎心脏畸形。本研究拟在体观察信号通路致胚胎心脏畸形。本研究拟在体观察mirna-19b 致致斑马鱼胚胎心脏畸形；应用基因沉默和过表达，论证斑马鱼胚胎心脏畸形；应用基因沉默和过表达，论证mirna-19b 影响影响wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建mir-19

9、b 表达载体和含表达载体和含野生型或突变体的野生型或突变体的wnt1 启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入p19 细胞，揭示细胞，揭示mir-19b 对对wnt1 的调控机制。研究具有源头创新性，并的调控机制。研究具有源头创新性，并可能阐明可能阐明mir-19b 致胚胎心脏畸形的机制，为先天性心脏病在胚胎期的早致胚胎心脏畸形的机制，为先天性心脏病在胚胎期的早期防治提供帮助。期防治提供帮助。立项依据立项依据 脊椎动物的心脏是胚胎发育过程中最早形成并行驶功能的器官，脊椎动物的心脏是胚胎发育过程中最早形成并行驶功能的器官，其发生需经由多细胞系特化、管状

10、结构形成、最后精确组装成成熟其发生需经由多细胞系特化、管状结构形成、最后精确组装成成熟4个心腔结构等发育过程，需要一系列重要的形态发生事件，包括细个心腔结构等发育过程，需要一系列重要的形态发生事件，包括细胞决定、细胞迁移和细胞分化等胞决定、细胞迁移和细胞分化等1，其间有多条信号通路（如，其间有多条信号通路（如wnt 信号通路、信号通路、notch 信号通路等）参与其发育调控信号通路等）参与其发育调控2,3，以保证胚胎心，以保证胚胎心脏形成在时间和空间的协调发育。由于心脏的血液循环功能对脊椎脏形成在时间和空间的协调发育。由于心脏的血液循环功能对脊椎动物的生存起关键作用，心脏发育畸形不但严重影响动

11、物生后的宫动物的生存起关键作用，心脏发育畸形不但严重影响动物生后的宫外生活质量，而且常导致流产、死胎等外生活质量，而且常导致流产、死胎等4，因此有关胚胎心脏畸形，因此有关胚胎心脏畸形的研究近年来受到普遍重视，并已成为预防医学领域疾病早期防治的研究近年来受到普遍重视，并已成为预防医学领域疾病早期防治的一个热点研究内容。的一个热点研究内容。 现已知，现已知，mirnas 参与调控胚胎心脏的发育，在心肌细胞的生参与调控胚胎心脏的发育，在心肌细胞的生长及分化过程中发挥着极其重要的作用长及分化过程中发挥着极其重要的作用5。已有研究报道靶向敲除。已有研究报道靶向敲除特异的特异的mirna 与心脏畸形密切相

12、关，其中敲除小鼠的与心脏畸形密切相关，其中敲除小鼠的mirna-1-2 导致导致50%小鼠发生室间隔缺损而死亡小鼠发生室间隔缺损而死亡, 存活小鼠解剖发现心室穿孔存活小鼠解剖发现心室穿孔6；敲除敲除mirna-133a-1/mirna-133a-2 的小鼠胚胎发生心脏心室壁变薄的小鼠胚胎发生心脏心室壁变薄和心室发育缺陷和心室发育缺陷7；在敲除斑马鱼胚胎；在敲除斑马鱼胚胎mirna-138 的研究中，发现的研究中，发现斑马鱼心房和心室发育异常，心肌前体细胞成熟受阻斑马鱼心房和心室发育异常，心肌前体细胞成熟受阻8。虽然上述。虽然上述与心脏畸形相关与心脏畸形相关mirnas 的研究已经取得了一些进展

13、，但目前明确的研究已经取得了一些进展，但目前明确对胚胎具有心脏致畸作用的对胚胎具有心脏致畸作用的mirnas 并不多，因而采用下一代测序并不多，因而采用下一代测序或生物芯片等技术筛选与胚胎期心脏畸形相关的差异或生物芯片等技术筛选与胚胎期心脏畸形相关的差异mirnas，对，对其表达调控机制进行研究显得尤为重要其表达调控机制进行研究显得尤为重要9。 近年来，采用下一代测序或生物芯片等技术主要用于筛选模式动物近年来，采用下一代测序或生物芯片等技术主要用于筛选模式动物（斑马鱼、小鼠）胚胎期心脏畸形相关的差异（斑马鱼、小鼠）胚胎期心脏畸形相关的差异mirnas，未见文献对心脏，未见文献对心脏畸形流产胎儿

14、心脏组织相关的差异畸形流产胎儿心脏组织相关的差异mirnas 的筛选研究报道的筛选研究报道5。本研究小。本研究小组利用我院产前超声诊断科对孕中期胎儿进行系统超声检查的优势，收集组利用我院产前超声诊断科对孕中期胎儿进行系统超声检查的优势，收集到超声筛查并确诊的胎儿左心发育不良孕妇（孕到超声筛查并确诊的胎儿左心发育不良孕妇（孕21w）3 例，家属从优生例，家属从优生优育的角度要求流产；同时收集到未婚先孕来我院要求流产的同胎龄优育的角度要求流产；同时收集到未婚先孕来我院要求流产的同胎龄3 例例正常胎儿的孕妇作为对照（见工作基础中图正常胎儿的孕妇作为对照（见工作基础中图1），征得医院伦理委员会和），征

15、得医院伦理委员会和孕妇家属的同意，对流产胎儿进行尸检并留取胎儿的心脏组织进行实验研孕妇家属的同意，对流产胎儿进行尸检并留取胎儿的心脏组织进行实验研究。我们在南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金究。我们在南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金（ m i r n a 在 胎 儿 先 天 性 心 脏 病 中 的 差 异 表 达 研 究 ， 项 目 号 ：在 胎 儿 先 天 性 心 脏 病 中 的 差 异 表 达 研 究 ， 项 目 号 ：nfykdx2010012，2010.12011.12，在研）的资助下，同时应用下一代，在研）的资助下，同时应用下一代测序和生物芯片技术对孕中

16、期左心发育不良流产胎儿心脏组织的测序和生物芯片技术对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织的mirna 表达谱进行分析，结果均发现表达谱进行分析，结果均发现8 个个mirna 在左心发育不良流产胎儿心脏在左心发育不良流产胎儿心脏组织与正常对照之间存在组织与正常对照之间存在3 倍以上的差异表达，并和倍以上的差异表达，并和real-time pcr 验证验证的结果一致（见工作基础中图的结果一致（见工作基础中图26）。其中）。其中mirna-19b 在进化上高度保守在进化上高度保守（见工作基础中表（见工作基础中表1）；在斑马鱼、犬、人的胚胎心脏发育早期及生后均）；在斑马鱼、犬、人的胚胎心脏发育早期及生后

17、均有表达有表达11,12；已有研究应用；已有研究应用mirna 芯片筛选成人扩张性心肌病人心脏组芯片筛选成人扩张性心肌病人心脏组织发现织发现mirna-19b 表达异常的报道表达异常的报道10；结合我们发现；结合我们发现mirna-19b 在孕中在孕中期左心发育不良胎儿心脏组织中表达明显上调，提示期左心发育不良胎儿心脏组织中表达明显上调，提示mirna-19b在心脏在心脏发育早期起到重要的作用。我们采用体外合成发育早期起到重要的作用。我们采用体外合成mirna-19b 前体显微注射前体显微注射入斑马鱼受精卵，结果发现受精后入斑马鱼受精卵，结果发现受精后72 h 斑马鱼心脏扩大，心肌管未能环斑马

18、鱼心脏扩大，心肌管未能环化，提示胚胎期化，提示胚胎期mirna-19b 过表达可致胚胎心脏畸形（见工作基础中图过表达可致胚胎心脏畸形（见工作基础中图7）。鉴于）。鉴于mirna-19b 致胚胎心脏畸形及其机制目前未见报道，因此有必致胚胎心脏畸形及其机制目前未见报道，因此有必要开展在体实验研究，并深入探讨其机制。要开展在体实验研究，并深入探讨其机制。 现已知，心脏起源于中胚层，其胚胎时期的发生发育主要受现已知，心脏起源于中胚层，其胚胎时期的发生发育主要受wnt 信号信号通路通路2、骨形态发生蛋白（、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，bmp）信号通路）信号通路1

19、3、notch 信号通路信号通路3等调控。其中，虽然等调控。其中，虽然bmp 信号通路与信号通路与notch 信号通信号通路在胚胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过路在胚胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过wnt 信号通路来完信号通路来完成心肌细胞的特化，提示成心肌细胞的特化，提示wnt 信号通路在胚胎心脏发育中的重要作用。经信号通路在胚胎心脏发育中的重要作用。经典的典的wnt 信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程2，配，配体体wnt1 蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞表面卷曲蛋白（蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞

20、表面卷曲蛋白（frizzled）家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中dsh（dishevelled）蛋）蛋白，抑制白，抑制gsk3（glycogen synthase kinase 3）的磷酸激酶活性，拮抗）的磷酸激酶活性，拮抗-连环蛋白（连环蛋白（-catenin）的降解，使其在胞质中大量聚集，并进入细胞核结）的降解，使其在胞质中大量聚集，并进入细胞核结合合tcf/lef 家族的转录因子，从而激活下游不同靶基因如家族的转录因子，从而激活下游不同靶基因如cyclin d 等，呈等，呈现其生物学效应现其生物学效应2。因此，经典的。因此，经典的w

21、nt 信号通路中，信号通路中，wnt1 是该信号通路是该信号通路的启动因子，的启动因子，gsk3是其功能的调节开关，而是其功能的调节开关，而-catenin 则是其功能的执则是其功能的执行者。行者。 我们通过生物信息学对我们通过生物信息学对mirna-19b 的靶基因进行预测的靶基因进行预测14，发现，发现wnt 信信号通路中关键蛋白号通路中关键蛋白wnt1 为其潜在靶基因，两者的互补结合序列在进化上高为其潜在靶基因，两者的互补结合序列在进化上高度保守（见工作基础中图度保守（见工作基础中图8）；本研究小组前期对孕鼠子代心脏发育异常的）；本研究小组前期对孕鼠子代心脏发育异常的实验研究中，发现孕鼠

22、子代心脏畸形与实验研究中，发现孕鼠子代心脏畸形与wnt 信号通路密切相关信号通路密切相关15，因而我，因而我们联想到是否们联想到是否wnt 信号通路也在信号通路也在mirna-19b 致胚胎心脏畸形中起到重要的致胚胎心脏畸形中起到重要的作用。我们进一步对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织中作用。我们进一步对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织中wnt 信号通路信号通路中关键分子（中关键分子（wnt1、gsk3、-catenin）的蛋白和基因水平进行研究，发）的蛋白和基因水平进行研究，发现现-catenin 表达下调，表达下调， gsk3 表达上调，两者表达上调，两者mrna 和蛋白水平的变化幅和

23、蛋白水平的变化幅度一致；而度一致；而wnt1 mrna 表达不变，蛋白表达水平下调（见工作基础中图表达不变，蛋白表达水平下调（见工作基础中图9），提示），提示wnt 信号通路在信号通路在mirna-19b 致胚胎心脏畸形中起作用，致胚胎心脏畸形中起作用，wnt1 可可能和能和mirna-19b 直接结合，抑制直接结合，抑制wnt1 的翻译，但不影响其转录，这和的翻译，但不影响其转录，这和mirna 通过碱基配对方式结合靶基因通过碱基配对方式结合靶基因mrna 的的3utr，导致靶基因的翻译，导致靶基因的翻译受抑制，但不影响其转录的特点是一致的受抑制，但不影响其转录的特点是一致的16，但这并不能

24、作为，但这并不能作为mirna-19b 与与wnt1 直接作用的证据，为了确认直接作用的证据，为了确认wnt1 是是mirna-19b 的直接靶位点，可的直接靶位点，可以采用荧光素酶报告基因实验进行鉴定以采用荧光素酶报告基因实验进行鉴定17。前期通过生物信息学预测发现。前期通过生物信息学预测发现wnt1 启动子的一段碱基序列启动子的一段碱基序列“uuugcac”和和mirna-19b上的保守序列上的保守序列“aaacgug”互补结合（见工作基础中图互补结合（见工作基础中图8），这可用于进行荧光素酶报），这可用于进行荧光素酶报告基因实验揭示告基因实验揭示mirna-19b 是否通过这个互补位点直

25、接结合靶基因是否通过这个互补位点直接结合靶基因wnt1，进而调控进而调控wnt 信号通路。信号通路。 鉴于上述分析和我们已获得的研究结论，本研究拟以早期心脏发生中鉴于上述分析和我们已获得的研究结论，本研究拟以早期心脏发生中发挥重要作用的发挥重要作用的wnt 信号通路为切入点，深入探讨信号通路为切入点，深入探讨mirna-19b 致胚胎心脏致胚胎心脏发育畸形的机制。首先通过分析发育畸形的机制。首先通过分析mirna-19b 过表达或表达沉默时斑马鱼心过表达或表达沉默时斑马鱼心脏发育情况（如心脏发育异常个体的百分比、心率）及对脏发育情况（如心脏发育异常个体的百分比、心率）及对wnt 信号通路的信号

26、通路的影响（原位杂交观察斑马鱼心肌中影响（原位杂交观察斑马鱼心肌中wnt信号通路中相关基因信号通路中相关基因wnt1、gsk3、-catenin 的表达水平），获得的表达水平），获得mirna-19b 影响影响wnt 信号通路致胚胎心脏发信号通路致胚胎心脏发育畸形较充分的实验证据；继而分别构建育畸形较充分的实验证据；继而分别构建wnt1 与与mirna-19b 的过表达或的过表达或沉默表达载体，通过双载体转染（沉默表达载体，通过双载体转染（“mirna-19b 沉默沉默+ wnt1 过表达过表达”或或“mirna-19b 过表达过表达+wnt1 沉默沉默”） 观察斑马鱼心脏发育情况，论证观察斑

27、马鱼心脏发育情况，论证mirna-19b影响影响wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建mirna-19b 表达载体和含野生型或突变体的表达载体和含野生型或突变体的wnt1 启动子的荧光素酶报告启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入中胚层来源的基因质粒，分别共转染入中胚层来源的p19 细胞，通过检测荧光素酶的活性细胞，通过检测荧光素酶的活性及及wnt 信号通路中关键分子信号通路中关键分子wnt1、gsk3、-catenin 的基因和蛋白表达水的基因和蛋白表达水平的变化，揭示平的变化，揭示mirna-19b 对对wnt1 的调控机制。由

28、于的调控机制。由于mirna-19b 致胚胎致胚胎心脏畸形及其机制研究目前未见报道，本研究具有源头创新性。研究若成心脏畸形及其机制研究目前未见报道，本研究具有源头创新性。研究若成功，将为阐明功，将为阐明mirna-19b 致胚胎心脏畸形的机制提供新的线索，为先天性致胚胎心脏畸形的机制提供新的线索，为先天性心脏病在妊娠期的早期防治提供新的理论依据。心脏病在妊娠期的早期防治提供新的理论依据。写作点评写作点评mir-19b致胚胎心脏畸形的机制研究致胚胎心脏畸形的机制研究(限限400字字)：mirnas 在胚胎心脏发育中发挥着重要的作用。前期应用下在胚胎心脏发育中发挥着重要的作用。前期应用下一代测序和

29、一代测序和mirna芯片筛选均发现心脏畸形芯片筛选均发现心脏畸形流产胎儿流产胎儿心脏组织中心脏组织中mir-19b 表达异常，表达异常，mir-19b 过表达可致斑马鱼心脏发育畸形；生物信息学分析发过表达可致斑马鱼心脏发育畸形；生物信息学分析发现现wnt1 为为mir-19b 的靶基因，在心脏畸形流产胎儿心脏组织中的靶基因，在心脏畸形流产胎儿心脏组织中wnt1 蛋白蛋白表达下调表达下调, wnt 信号通路下游蛋白信号通路下游蛋白gsk3表达上调，提示表达上调，提示mir-19b 可能通可能通过影响过影响wnt 信号通路致胚胎心脏畸形。本研究拟在体观察信号通路致胚胎心脏畸形。本研究拟在体观察mi

30、rna-19b 致致斑马鱼胚胎心脏畸形；应用基因沉默和过表达，论证斑马鱼胚胎心脏畸形；应用基因沉默和过表达，论证mirna-19b 影响影响wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建mir-19b 表达载体和含表达载体和含野生型或突变体的野生型或突变体的wnt1 启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入p19 细胞，揭示细胞，揭示mir-19b 对对wnt1 的调控机制。研究具有源头创新性，并的调控机制。研究具有源头创新性，并可能阐明可能阐明mir-19b 致胚胎心脏畸形的机制，为先天性心脏病在胚

31、胎期的早致胚胎心脏畸形的机制，为先天性心脏病在胚胎期的早期防治提供帮助。期防治提供帮助。 mir-19b是我们应用下一代测序技术、结合是我们应用下一代测序技术、结合mirna芯片，筛选芯片，筛选发现的一条在左心发育不良流产胚胎心肌组织中表达显著上调的发现的一条在左心发育不良流产胚胎心肌组织中表达显著上调的mirna。前期发现：前期发现：mir-19b过表达可致斑马鱼出现心脏畸形表型；过表达可致斑马鱼出现心脏畸形表型；生物信息学预测生物信息学预测wnt1是是mir-19b的靶基因，我们则发现畸形胚胎心的靶基因，我们则发现畸形胚胎心肌组织中肌组织中wnt信号通路也明显受抑（信号通路也明显受抑（wn

32、t1表达下调、表达下调、gsk3表达上表达上调），提示调），提示mir-19b致胚胎心脏发育畸形的机制与致胚胎心脏发育畸形的机制与wnt信号通路有信号通路有关。关。本研究拟：在体观察本研究拟：在体观察mir-19b过表达、表达沉默与斑马鱼胚胎过表达、表达沉默与斑马鱼胚胎心脏畸形、心脏畸形、wnt信号通路变化间的关系；以信号通路变化间的关系；以wnt信号通路为切入点，信号通路为切入点，结合吗啡啉修饰的反义寡核苷酸技术和过表达技术，评判结合吗啡啉修饰的反义寡核苷酸技术和过表达技术，评判mir-19b致胚胎心脏发育畸形的机制；采用荧光素酶报告基因技术，揭示致胚胎心脏发育畸形的机制；采用荧光素酶报告基

33、因技术，揭示mir-19b对对wnt1的分子调控机制。的分子调控机制。mir-19b致胚胎心脏发育畸形及致胚胎心脏发育畸形及机制研究未见报道，本研究有源头创新性，可为早期先心病的防治机制研究未见报道，本研究有源头创新性，可为早期先心病的防治提供新线索和潜在的干预靶标。提供新线索和潜在的干预靶标。 立项依据立项依据 脊椎动物的心脏是胚胎发育过程中最早形成并行驶功能的器官，脊椎动物的心脏是胚胎发育过程中最早形成并行驶功能的器官，其发生需经由多细胞系特化、管状结构形成、最后精确组装成成熟其发生需经由多细胞系特化、管状结构形成、最后精确组装成成熟4个心腔结构等发育过程，需要一系列重要的形态发生事件，包

34、括细个心腔结构等发育过程，需要一系列重要的形态发生事件，包括细胞决定、细胞迁移和细胞分化等胞决定、细胞迁移和细胞分化等1，其间有多条信号通路（如，其间有多条信号通路（如wnt 信号通路、信号通路、notch 信号通路等信号通路等）参与其发育调控）参与其发育调控2,3，以保证胚胎心，以保证胚胎心脏形成在时间和空间的协调发育。由于心脏的血液循环功能对脊椎脏形成在时间和空间的协调发育。由于心脏的血液循环功能对脊椎动物的生存起关键作用，心脏发育畸形不但严重影响动物生后的宫动物的生存起关键作用，心脏发育畸形不但严重影响动物生后的宫外生活质量，而且常导致流产、死胎等外生活质量，而且常导致流产、死胎等4，因

35、此有关胚胎心脏畸形，因此有关胚胎心脏畸形的研究近年来受到普遍重视，并已成为预防医学领域疾病早期防治的研究近年来受到普遍重视，并已成为预防医学领域疾病早期防治的一个热点研究内容。的一个热点研究内容。 现已知，现已知，mirnas 参与调控胚胎心脏的发育，在心肌细胞的生参与调控胚胎心脏的发育，在心肌细胞的生长及分化过程中发挥着极其重要的作用长及分化过程中发挥着极其重要的作用5。已有研究报道靶向敲除。已有研究报道靶向敲除特异的特异的mirna 与心脏畸形密切相关，其中敲除小鼠的与心脏畸形密切相关，其中敲除小鼠的mirna-1-2 导致导致50%小鼠发生室间隔缺损而死亡小鼠发生室间隔缺损而死亡, 存活

36、小鼠解剖发现心室穿孔存活小鼠解剖发现心室穿孔6；敲除敲除mirna-133a-1/mirna-133a-2 的小鼠胚胎发生心脏心室壁变薄的小鼠胚胎发生心脏心室壁变薄和心室发育缺陷和心室发育缺陷7；在敲除斑马鱼胚胎；在敲除斑马鱼胚胎mirna-138 的研究中，发现的研究中，发现斑马鱼心房和心室发育异常，心肌前体细胞成熟受阻斑马鱼心房和心室发育异常，心肌前体细胞成熟受阻8。虽然上述。虽然上述与心脏畸形相关与心脏畸形相关mirnas 的研究已经取得了一些进展，但目前明确的研究已经取得了一些进展，但目前明确对胚胎具有心脏致畸作用的对胚胎具有心脏致畸作用的mirnas 并不多，因而采用下一代测序并不多

37、，因而采用下一代测序或生物芯片等技术筛选与胚胎期心脏畸形相关的差异或生物芯片等技术筛选与胚胎期心脏畸形相关的差异mirnas，对，对其表达调控机制进行研究显得尤为重要其表达调控机制进行研究显得尤为重要9。 近年来，采用下一代测序或生物芯片等技术主要用于筛选模式动物近年来，采用下一代测序或生物芯片等技术主要用于筛选模式动物（斑马鱼、小鼠）胚胎期心脏畸形相关的差异（斑马鱼、小鼠）胚胎期心脏畸形相关的差异mirnas，未见文献对心脏，未见文献对心脏畸形流产胎儿心脏组织相关的差异畸形流产胎儿心脏组织相关的差异mirnas 的筛选研究报道的筛选研究报道5。本研究小。本研究小组利用我院产前超声诊断科对孕中

38、期胎儿进行系统超声检查的优势，收集组利用我院产前超声诊断科对孕中期胎儿进行系统超声检查的优势，收集到超声筛查并确诊的胎儿左心发育不良孕妇（孕到超声筛查并确诊的胎儿左心发育不良孕妇（孕21w）3 例，家属从优生例，家属从优生优育的角度要求流产；同时收集到未婚先孕来我院要求流产的同胎龄优育的角度要求流产；同时收集到未婚先孕来我院要求流产的同胎龄3 例例正常胎儿的孕妇作为对照（正常胎儿的孕妇作为对照（见工作基础中图见工作基础中图1 1），征得医院伦理委员会和），征得医院伦理委员会和孕妇家属的同意，对孕妇家属的同意，对流产胎儿流产胎儿进行尸检并留取胎儿的心脏组织进行实验研进行尸检并留取胎儿的心脏组织进

39、行实验研究。我们在南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金究。我们在南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金（ m i r n a 在 胎 儿 先 天 性 心 脏 病 中 的 差 异 表 达 研 究 ， 项 目 号 ：在 胎 儿 先 天 性 心 脏 病 中 的 差 异 表 达 研 究 ， 项 目 号 ：nfykdx2010012，2010.12011.12，在研，在研）的资助下，同时应用下一代）的资助下，同时应用下一代测序和生物芯片技术对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织的测序和生物芯片技术对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织的mirna 表达谱进行分析，结果均发现表达谱进行分

40、析，结果均发现8 个个mirna 在左心发育不良流产胎儿心脏在左心发育不良流产胎儿心脏组织与正常对照之间存在组织与正常对照之间存在3 倍以上的差异表达，并和倍以上的差异表达，并和real-time pcr 验证验证的结果一致（的结果一致（见工作基础中图见工作基础中图26）。其中）。其中mirna-19b 在进化上高度保守在进化上高度保守（见工作基础中表见工作基础中表1）；在斑马鱼、犬、人的胚胎心脏发育早期及生后均）；在斑马鱼、犬、人的胚胎心脏发育早期及生后均有表达有表达11,12；已有研究应用；已有研究应用mirna 芯片筛选成人扩张性心肌病人心脏组芯片筛选成人扩张性心肌病人心脏组织发现织发现

41、mirna-19b 表达异常的报道表达异常的报道10；结合我们发现；结合我们发现mirna-19b 在孕中在孕中期左心发育不良胎儿心脏组织中表达明显上调，提示期左心发育不良胎儿心脏组织中表达明显上调，提示mirna-19b在心脏在心脏发育早期起到重要的作用。我们采用体外合成发育早期起到重要的作用。我们采用体外合成mirna-19b 前体显微注射前体显微注射入斑马鱼受精卵，结果发现受精后入斑马鱼受精卵，结果发现受精后72 h 斑马鱼心脏扩大，心肌管未能环斑马鱼心脏扩大，心肌管未能环化，提示胚胎期化，提示胚胎期mirna-19b 过表达可致胚胎心脏畸形（过表达可致胚胎心脏畸形（见工作基础中图见工作

42、基础中图7）。鉴于）。鉴于mirna-19b 致胚胎心脏畸形及其机制目前未见报道，因此有必致胚胎心脏畸形及其机制目前未见报道，因此有必要开展在体实验研究，并深入探讨其机制。要开展在体实验研究，并深入探讨其机制。 前期研究中，本研究小组在南方医科大学生物电子学国家重点实验室前期研究中，本研究小组在南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金开放研究基金mirna 在胎儿先天性心脏病中的差异表达研究，项目号：在胎儿先天性心脏病中的差异表达研究，项目号：nfykdx 2009012，医学伦理号：粤妇伦字医学伦理号：粤妇伦字( 2009) 3 号号 的资助下，以孕的资助下，以孕21 周超声诊断为左

43、心发育不良、自然流产的周超声诊断为左心发育不良、自然流产的胚胎样本为胚胎样本为研究对象，采用下研究对象，采用下一代测序技术，结合生物芯片的应用，以两种高通量技术同时筛选左心发一代测序技术，结合生物芯片的应用，以两种高通量技术同时筛选左心发育不良胚胎心脏中的差异育不良胚胎心脏中的差异mirnas，结果发现在两种高通量筛选数据中同，结果发现在两种高通量筛选数据中同时出现的、时出现的、3 倍以上的差异倍以上的差异mirnas 8 个，且个，且real-time pcr 验证结果与其验证结果与其初筛结果基本一致（见工作基础中图初筛结果基本一致（见工作基础中图18）。其中，）。其中，人人mir-19b

44、差异高表达差异高表达于孕中期左心发育不良胚胎心脏组织中，且因：于孕中期左心发育不良胚胎心脏组织中，且因：该该mirna 在进化上高度在进化上高度保守（见工作基础中表保守（见工作基础中表1）；）；斑马鱼、犬等多种生物的胚胎心脏中该斑马鱼、犬等多种生物的胚胎心脏中该mirna 均有表达均有表达10,11；mirna芯片筛选研究发现，成人扩张性心肌病芯片筛选研究发现，成人扩张性心肌病患者心肌重构的心肌组织中患者心肌重构的心肌组织中mir-19b 异常表达异常表达 12 ，均提示，均提示mir-19b 在心脏在心脏发育早期可能具有重要作用，而引起本研究小组的关注。发育早期可能具有重要作用，而引起本研究

45、小组的关注。 鉴于斑马鱼是一种新兴的模式生物，不但胚胎小，而且拥有并不完全鉴于斑马鱼是一种新兴的模式生物，不但胚胎小，而且拥有并不完全依赖心血管系统生存的生命特征（即使整个心血管系统缺失，也能通过氧依赖心血管系统生存的生命特征（即使整个心血管系统缺失，也能通过氧的被动运输机制而生存，并继续发育一段时间），能为心脏发育研究提供的被动运输机制而生存，并继续发育一段时间），能为心脏发育研究提供极为有利的条件，是活体评估心脏发育相关基因功能的常用技术平台极为有利的条件，是活体评估心脏发育相关基因功能的常用技术平台13，因此，我们首先体外合成用于人因此，我们首先体外合成用于人mir-19b 过表达研究的

46、过表达研究的mir-19b 前体前体（mirna-19b precursor，pre-mir-19b），显微注射入斑马鱼受精卵，来），显微注射入斑马鱼受精卵，来评估评估mir-19b 在胚胎心脏发育中的作用。结果发现，过表达在胚胎心脏发育中的作用。结果发现，过表达mir-19b 导致导致斑马鱼出现心包水肿，心脏环化不完全，心房、心室结构异常（见工作基斑马鱼出现心包水肿，心脏环化不完全，心房、心室结构异常（见工作基础中图础中图9），初步获得了），初步获得了mir-19b 致胚胎心脏发育畸形的形态学依据。由于致胚胎心脏发育畸形的形态学依据。由于mir-19b 致胚胎心脏畸形及其机制目前国内外均未见

47、报道，致胚胎心脏畸形及其机制目前国内外均未见报道，因此进一步论因此进一步论证证mir-19b 与心脏发育畸形之间的关系、深入分析其分子调控机制就显得与心脏发育畸形之间的关系、深入分析其分子调控机制就显得十分必要。十分必要。 现已知，心脏起源于中胚层，其胚胎时期的发生发育主要受现已知，心脏起源于中胚层，其胚胎时期的发生发育主要受wnt 信号信号通路通路2、骨形态发生蛋白（、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，bmp）信号通路）信号通路13、notch 信号通路信号通路3等调控。其中，等调控。其中，虽然虽然bmp 信号通路与信号通路与notch 信号通信号通路在胚

48、胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过路在胚胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过wnt 信号通路来完信号通路来完成心肌细胞的特化，提示成心肌细胞的特化，提示wnt 信号通路在胚胎心脏发育中的重要作用。信号通路在胚胎心脏发育中的重要作用。经经典的典的wnt 信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程2，配，配体体wnt1 蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞表面卷曲蛋白（蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞表面卷曲蛋白（frizzled）家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中dsh（

49、dishevelled）蛋）蛋白，抑制白，抑制gsk3（glycogen synthase kinase 3）的磷酸激酶活性，拮抗）的磷酸激酶活性，拮抗-连环蛋白（连环蛋白（-catenin）的降解，使其在胞质中大量聚集，并进入细胞核结）的降解，使其在胞质中大量聚集，并进入细胞核结合合tcf/lef 家族的转录因子，从而激活下游不同靶基因如家族的转录因子，从而激活下游不同靶基因如cyclin d 等，呈等，呈现其生物学效应现其生物学效应2。因此，经典的。因此，经典的wnt 信号通路中，信号通路中，wnt1 是该信号通路是该信号通路的启动因子，的启动因子，gsk3是其功能的调节开关，而是其功能的

50、调节开关，而-catenin 则是其功能的执则是其功能的执行者。行者。 我们通过生物信息学对我们通过生物信息学对mirna-19b 的靶基因进行预测的靶基因进行预测14，发现，发现wnt 信信号通路中关键蛋白号通路中关键蛋白wnt1 为其潜在靶基因，两者的互补结合序列在进化上高为其潜在靶基因，两者的互补结合序列在进化上高度保守（见工作基础中图度保守（见工作基础中图8）；本研究小组前期对孕鼠子代心脏发育异常的）；本研究小组前期对孕鼠子代心脏发育异常的实验研究中，发现孕鼠子代心脏畸形与实验研究中，发现孕鼠子代心脏畸形与wnt 信号通路密切相关信号通路密切相关15，因而我，因而我们联想到是否们联想到

51、是否wnt 信号通路也在信号通路也在mirna-19b 致胚胎心脏畸形中起到重要的致胚胎心脏畸形中起到重要的作用。我们进一步对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织中作用。我们进一步对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织中wnt 信号通路信号通路中关键分子（中关键分子（wnt1、gsk3、-catenin）的蛋白和基因水平进行研究，发）的蛋白和基因水平进行研究，发现现-catenin 表达下调，表达下调， gsk3 表达上调，两者表达上调，两者mrna 和蛋白水平的变化幅和蛋白水平的变化幅度一致；而度一致；而wnt1 mrna 表达不变，蛋白表达水平下调（见工作基础中图表达不变，蛋白表达水平下调（见

52、工作基础中图9），提示），提示wnt 信号通路在信号通路在mirna-19b 致胚胎心脏畸形中起作用，致胚胎心脏畸形中起作用，wnt1 可可能和能和mirna-19b 直接结合，抑制直接结合，抑制wnt1 的翻译，但不影响其转录，这和的翻译，但不影响其转录，这和mirna 通过碱基配对方式结合靶基因通过碱基配对方式结合靶基因mrna 的的3utr，导致靶基因的翻译，导致靶基因的翻译受抑制，但不影响其转录的特点是一致的受抑制，但不影响其转录的特点是一致的16，但这并不能作为，但这并不能作为mirna-19b 与与wnt1 直接作用的证据，为了确认直接作用的证据，为了确认wnt1 是是mirna-

53、19b 的直接靶位点，可的直接靶位点，可以采用荧光素酶报告基因实验进行鉴定以采用荧光素酶报告基因实验进行鉴定17。前期通过生物信息学预测发现。前期通过生物信息学预测发现wnt1 启动子的一段碱基序列启动子的一段碱基序列“uuugcac”和和mirna-19b上的保守序列上的保守序列“aaacgug”互补结合（见工作基础中图互补结合（见工作基础中图8），这可用于进行荧光素酶报），这可用于进行荧光素酶报告基因实验揭示告基因实验揭示mirna-19b 是否通过这个互补位点直接结合靶基因是否通过这个互补位点直接结合靶基因wnt1，进而调控进而调控wnt 信号通路。信号通路。 为探索为探索mir-19b

54、 致胚胎心脏畸形的可能机制，寻找深入研究的有用线致胚胎心脏畸形的可能机制，寻找深入研究的有用线索索，我们进一步采用生物信息学分析的方法，来预测，我们进一步采用生物信息学分析的方法，来预测mir-19b 可能的下游可能的下游靶基因。结果发现，靶基因。结果发现，wnt 信号通路中关键蛋白信号通路中关键蛋白wnt1 为其潜在的作用靶点，为其潜在的作用靶点，且且mir-19b 与靶基因与靶基因wnt1 的互补结合序列在进化上也高度保守、同源性达的互补结合序列在进化上也高度保守、同源性达100%（见工作基础中图（见工作基础中图10）。由于：）。由于：心脏起源于中胚层，其胚胎时期的心脏起源于中胚层，其胚胎

55、时期的发生发育主要受发生发育主要受wnt、骨形态发生蛋白（、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，bmp）、）、notch 等信号通路的调控等信号通路的调控2-3, 14，bmp、notch 信号通路尽管在胚信号通路尽管在胚胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过wnt 信号通路来完成心肌信号通路来完成心肌细胞的特化，提示了细胞的特化，提示了wnt 信号通路在胚胎心脏发育中的重要性；信号通路在胚胎心脏发育中的重要性；本研究本研究小组在先前国家自然科学基金（项目号小组在先前国家自然科学基金（项目号30672245）资助下

56、，开展孕期叶酸）资助下，开展孕期叶酸缺乏影响子代心脏发育的机制研究时，也证实了缺乏影响子代心脏发育的机制研究时，也证实了wnt 信号通路调节异常与信号通路调节异常与胚胎心脏发育畸形之间的密切关系胚胎心脏发育畸形之间的密切关系 15，因此我们设想因此我们设想mir-19b 可能通过调可能通过调控在种系进化上高度保守、在心脏发育早期极为重要的控在种系进化上高度保守、在心脏发育早期极为重要的wnt1 而发挥作用，而发挥作用，以以wnt 信号途径为机制研究的切入点，有可能帮助我们揭示信号途径为机制研究的切入点，有可能帮助我们揭示mir-19b 致胚致胚胎心脏畸形的分子机制。胎心脏畸形的分子机制。 现已

57、知，现已知，经典的经典的wnt 信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程等过程2，配体配体wnt1 蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞表面卷曲蛋白蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞表面卷曲蛋白（frizzled）家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中）家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中dsh（dishevelled）蛋白，抑制）蛋白，抑制gsk3（ glycogen synthase kinase 3）的磷酸激）的磷酸激酶活性，拮抗酶活性，拮抗-连环蛋白（连环蛋白（-catenin）的降解，使其在胞质中大量聚集，并）的降解，

58、使其在胞质中大量聚集，并进入细胞核发挥其生物学效应进入细胞核发挥其生物学效应2。因此，经典的。因此，经典的wnt 信号通路中，信号通路中，wnt1 是是该信号通路的启动因子，该信号通路的启动因子，gsk3 是其功能的调节开关，而是其功能的调节开关，而-catenin 则是其则是其功能的执行者。据此，功能的执行者。据此，我们以孕中期左心发育不良胚胎心脏组织为检测样本，我们以孕中期左心发育不良胚胎心脏组织为检测样本，采用采用real time pcr、western blot 技术，检测了技术，检测了wnt 信号通路中几个关键信号通路中几个关键分子（分子（wnt1、gsk3、-catenin）的基

59、因、蛋白表达水平变化。）的基因、蛋白表达水平变化。 结果发现，孕中期左心发育不良胚胎心肌组织中结果发现，孕中期左心发育不良胚胎心肌组织中wnt1、-catenin 基因基因与蛋白表达均显著下调，与蛋白表达均显著下调，gsk3基因与蛋白的表达则显著上调，提示左心发基因与蛋白的表达则显著上调，提示左心发育不良胚胎心肌组织中存在育不良胚胎心肌组织中存在wnt 信号通路明显受抑的现象。其中，信号通路明显受抑的现象。其中，gsk3、-catenin 在基因、蛋白表达水平的变化幅度基本一致，在基因、蛋白表达水平的变化幅度基本一致，wnt1 基因、蛋白表基因、蛋白表达水平的变化幅度则不一致，左心发育不良胚胎

60、心肌组织中达水平的变化幅度则不一致，左心发育不良胚胎心肌组织中wnt1 蛋白表达蛋白表达下调的程度更高（见工作基础中图下调的程度更高（见工作基础中图11），符合我们的预期，此与），符合我们的预期，此与mirna与与靶基因特异性碱基互补配对后主要抑制其蛋白翻译、不抑制其转录等特点相靶基因特异性碱基互补配对后主要抑制其蛋白翻译、不抑制其转录等特点相一致一致16。该研究结果提示，。该研究结果提示，wnt1 可能不仅仅是可能不仅仅是mir-19b 调控的下游靶基因，调控的下游靶基因，而且而且mir-19b 在致胚胎心脏发育畸形中的作用极可能通过影响在致胚胎心脏发育畸形中的作用极可能通过影响wnt 信号