中枢酸敏感离子通道对家兔呼吸活动调节的影响-复旦学报医学院版

1、中枢酸敏感离子通道对家兔呼吸活动调节的影响杨达伟1 张函1 陶雪飞1 陈珏伟1 宋娜娜2 沈霖霖2(1复旦大学中山医院；2生理与病理生理学系 上海 200032)【摘要】目的 观察中枢pH值改变对家兔呼吸活动调节的影响。方法 8只乌拉坦麻醉的成年家兔，记录膈神经放电信号，同时记录心电活动；一侧侧脑室微量注射不同pH的酸化人工脑脊液（pH=7.4、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0，20µL）及酸敏感离子通道的阻断剂（Amiloride），NMDA受体激动剂（NMDA）和阻断剂（MK-801）。分析呼吸的频率、膈神经放电的积分面积和心率的改变。结果 （1）侧脑室微量注射不同pH 值

2、的酸化脑脊液后，家兔呼吸频率显著增加，于pH 5.0达到最大效应，但在pH 4.0时呼吸频率的增加减弱。膈神经放电的积分面积与心率无明显变化。（2）侧脑室微量注射Amiloride后，酸化脑脊液引起家兔呼吸活动的兴奋作用减弱（P<0.01, P<0.05）。（3）侧脑室微量注射MK-801后，酸化脑脊液引起家兔呼吸活动的兴奋作用减弱，但没有统计学差异。微量注射NMDA后，酸化脑脊液引起家兔呼吸活动的兴奋作用增加（P<0.05）。结论 家兔呼吸频率与侧脑室内pH值呈反向U型剂量关系，效应在pH 5.0时达顶峰。酸敏感离子通道的直接阻断剂Amiloride可以有效抑制酸化对呼吸中

3、枢的兴奋作用，提示氢离子介导的呼吸中枢兴奋的调节机制与酸敏感离子通道有关。NMDA增加氢离子兴奋呼吸中枢的作用和NMDA受体阻断剂MK-801抑制氢离子兴奋呼吸中枢的作用，提示上游兴奋性氨基酸受体可能参与对酸敏感离子通道的调节。【关键词】酸敏感离子通道；酸化人工脑脊液；Amiloride；NMDA；MK-801；膈神经【中图分类号】 Q473 【文献标识码】 AEffects of central acid sensing ion channels on modulation of respiratory activity in rabbitsYANG Da-wei 1 ZHANG Han 1

4、 TAO Xue-fei 1 CHEN Jue-wei 1 SONG Na-na 2 SHEN Lin-lin 2(1 Clinical Medicine; 2Department of Physiology and Pathophysiology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)【Abstract】Objective Present study investigated the effect of different pH artificial cerebrospinal fluid (A

5、CSF) on modulation of respiratory activity in rabbits. Methods Experiment was performed on adult rabbits (n=8) with urethane anesthetized. The phrenic nerve discharge (PND) and electrocardiogram (ECG) were recorded simultaneously. Respiratory rate (RR) and integral value of PND were calculated from

6、PND recording. Heart rate (HR) was calculated from ECG. Acidic ACSF (pH=7.4, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.0, 20µl) and antagonist of ASICs or NMDA were microinjected into lateral ventricle (LV) in medulla. Results (1) Microinjection of acidic ACSF induced a rise in RR compared to normal saline without

7、 change of PND and HR. The response peak of RR was at pH 5.0. However it was less at pH 4.0 than at pH 5.0. (2) Amiloride, direct antagonist of ASICs, attenuated the RR response to acidic ACSF at pH 5.0 (P<0.01, P<0.05). (3) MK-801, indirect antagonist of ASICs, also showed the trend of decrea

8、sing on RR without significance. NMDA increased the RR responding to acidic ACSF (P<0.05). Conclusions The data indicates an inversely U-shape does-response relationship between central pH concentration and respiratory rate. The response peak of RR was at pH 5.0. Effect of Amiloride indicates tha

9、t ASICs are involved in modulation of respiration. It may also suggest that NMDA is one of the participation of ASICs signaling mechanism.【Key Words】acid sensing ion channel (ASIC); acidic artificial cerebrospinal fluid (AACSF); Amiloride; NMDA; MK-801; phrenic nerve自从Waldmann等1在1997年克隆了第一个酸敏感离子通道(a

10、cid sensing ion channels, ASICs)亚基后，对ASICs的研究成为近几年来生理学和神经生物学中发展最为迅速的领域之一。ASICs通道属于钠离子通道/退化蛋白（Na+ channel/degenerin, NaC/DEG）家族中的一员，其共同特点是均为非电压门控的对Na+有高通透性的离子通道，且均可被Amiloride所阻断。在证明了ASICs参与味觉2、触觉3、痛觉4、及学习记忆5、精神功能的调节6等生理方面的功能之后，近几年又在心绞痛7、炎症8、视网膜变性9及缺血性脑损伤10等病理过程中，发现其具有一定的调节功能。但目前国内外还没有关于ASICs参与中枢氢离子浓度

11、改变引起呼吸调节的相关报道。本文通过酸化人工脑脊液构建家兔呼吸中枢兴奋模型，选用ASICs的直接阻断剂Amilorde与另一种未经证实的间接阻断剂MK-801，MK-801其作用机制可能通过阻断ASICs上游兴奋性氨基酸受体（NMDA受体），抑制ASICs蛋白的磷酸化。探寻ASICs参与呼吸中枢兴奋的相关机制与途径，同时寻找更为有效和特异性的通道阻断剂，为临床呼吸中枢神经调节障碍的诊断和治疗提供理论依据。材料和方法药品 20%乌拉坦，人工脑脊液（g/L）：NaCl 7.6，KCl 0.373，NaH2PO4 0.192，CaCl2 0.2886，MgSO4 0.23，NaHCO3 2.18，葡

12、萄糖 1.98，蔗糖 3.42，调pH至7.4，6.5，6.0，5.5，5.0，4.0配成酸化脑脊液，生理盐水，Amiloride、MK-801、NMDA购自Sigma公司。动物制备 健康成年家兔8只，体重1.82.5kg，由复旦大学医学院动物部提供，乌拉坦（5mL/kg）耳缘静脉麻醉，气管插管，记录II导联心电和颈总动脉血压。实验动物分组 共分为3个实验组。第1组为人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid, ACSF）的pH梯度实验，n=6，家兔一侧侧脑室依次注射生理盐水、pH值为7.4的正常脑脊液、pH值分别为7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.0的

13、酸化脑脊液。将空白、生理盐水和正常脑脊液作为对照。第2组为ASICs直接阻断剂Amiloride实验，n=3，Amiloride（1mmol/L与10mmol/L）与pH值为5.0的ACSF同时给药，以pH值为5.0的ACSF作为对照。第3组为ASICs间接阻断剂MK-801实验，其中A组（n=2）为MK-801（10mol/L与10mmol/L）与pH值为5.0的ACSF同时给药，B组（n=2）为NMDA（10mmol/L与100mmol/L）与pH值为5.0的ACSF同时给药，均以pH值为5.0的ACSF作为对照。侧脑室给药方法 使用脑立体定位仪，根据Sawyer 图谱值（P4 L/R5

14、H5）定位侧脑室，使用不锈钢外套管进针，内套管连接20L微量注射器给药。每次注射20L，1min内完成，留针1min。膈神经放电记录 动物取仰卧位，在颈外静脉与颈内静脉角的深处找到臂丛神经，分离跨过臂丛的膈神经，并从俯卧位肩胛骨上缘重新找出，制作皮兜，挂上双极银丝电极记录膈神经的放电活动。神经信号记录使用SMUP-PC型生物信号处理系统，通过MFLab软件记录信号，并作信号后处理获得呼吸频率与膈神经放电积分面积。统计学处理实验观察指标：呼吸频率(RR)、膈神经放电积分面积(PND)和心率(HR)。所有样本以x±SE表示，采用Microsoft Excel中t检验进行统计分析，以P&l

15、t;0.05为有统计学差异。结果记录正常家兔呼吸活动和心率实验中记录的参数如图1 所示，正常家兔平均动脉血压为117mmHg，膈神经呈有规律的簇集放电，平均放电频率为26bmp，平均心律为264bmp，平均膈神经放电积分为2.93mV*s。图1 实验中记录的各参数Fig 1 Recorded parameters in the experiment侧脑室微量注射酸化脑脊液对家兔呼吸活动和心率的影响 在6只家兔侧脑室按照pH值由高到低依次注射20L酸化人工脑脊液，实验中观察到家兔呼吸频率随pH值降低而增加，于pH 5.0时达到峰值（44±11bmp）。生理盐水组的呼吸频率与空白对照组的

16、呼吸频率之间没有显著差异（P>0.05）。与生理盐水组的呼吸频率（27±3bmp）相比，pH 6.0，5.5，5.0与4.0时呼吸频率的改变具有统计学意义（P<0.01, P<0.05），其值分别为42±9bmp，43±12bmp，44±11bmp与38±5bmp（图2）。另外在相邻组组间呼吸频率的比较中发现pH 6.0与6.5两组间的呼吸频率有显著差异（P<0.05）。家兔膈神经放电积分面积、心率与生理盐水对照组比较均无显著差异（P>0.05)（表1）。表 1 注射酸化人工脑脊液对家兔呼吸活动和心率的影响 Tab

17、 1 Effects of microinjection of acidic ACSF on respiration and heart rate (n=6，x±SE)RR (bmp)PND (mV*s)HR (bmp)Control29±42.39±2.39209±55N.S.27±32.32±2.51207±60pH 7.427±62.62±2.90211±526.5 32±42.18±2.05210±516.0 42±9(2)2.21±2.

18、23208±485.5 43±12(1)2.34±2.46205±485.0 44±11(2)2.49±2.40205±504.0 38±5(2)2.44±2.29201±49(1)P<0.05, (2)P<0.01 vs N.S.侧脑室微量注射Amiloride对家兔呼吸活动和心率的影响 家兔侧脑室微量注射1mmol/L与10mmol/L两个浓度的Amiloride后，再注射pH 5.0的酸化人工脑脊液，家兔呼吸频率分别为23±5bmp(n=3)与27±5bmp

19、(n=3)，与pH 5.0的呼吸频率41±5bmp(n=4)相比，有显著性差异（P<0.01, P<0.05），（图3）。10mmol/L浓度组膈神经放电积分面积10.76±4.80mV*s(n=3)，与pH 5.0的放电积分面积2.45±3.51 mV*s (n=4)相比有显著性差异（P<0.05），家兔心率与pH 5.0相比无显著性差异（P>0.05）（表2）。表 2 注射Amiloride对家兔呼吸活动和心率的影响 Tab 2 Effects of microinjection of Amiloride on respiration

20、and heart rate (x±SE)RR (bmp)PND (mV*s)HR (bmp)Control (n=4)30±52.37±2.76223±28N.S. (n=4)27±42.53±3.03221±27pH 5.0 (n=4)41±52.45±3.51219±40Amiloride(1mmol/L) 5.0 (n=3)23±5(2)2.94±3.18212±37Amiloride(10mmol/L) 5.0 (n=3)27±5(1)10.76

21、±4.80(1)223±37(1)P<0.05, (2)P<0.01 vs pH 5.0侧脑室微量注射MK-801及NMDA对家兔呼吸活动和心率的影响 实验分成两组，A组于侧脑室微量注射10mol/L与10mmol/L两个浓度的MK-801，B组注射10mmol/L与100mmol/L两个浓度的NMDA后，再分别注射pH 5.0的酸化人工脑脊液实验。与pH 5.0时的呼吸频率43±6bmp(n=3)相比，两组MK-801的呼吸频率都有所降低，分别为31±5bmp(n=2)与34±6bmp(n=2)，但均无显著性差异（P>0.0

22、5）。10mmol/L浓度的NMDA时呼吸频率为41±12bmp(n=2)，无显著性差异（P>0.05），100mmol/L浓度组的呼吸频率加快到55±1bmp(n=2)，有显著性差异(P<0.05)，（图4）。各组家兔膈神经放电积分面积和心率与pH 5.0相比无显著性差异（数据没有列出）。讨论在实验中发现，家兔呼吸频率的增加呈氢离子浓度依赖性，与生理盐水对照组的呼吸频率相比，pH下降到6.0时，发生明显改变（P<0.05），而于pH 5.0时达到峰值，pH 4.0时呼吸频率的增加有所下降，呼吸频率的改变在注射pH梯度人工脑脊液的过程中，呈反向U型剂量关系

23、。这与之前有关组织pH值改变的相关研究结果大致相符，Kay Steen等11在对大鼠的痛觉传入神经与组织酸化的研究中发现，神经放电在pH 6.1至5.2之间与对照组相比平均增加2倍，而在pH5.2至pH4.3的范围内放电增加有所减弱。另外，Mette Hesselager等12通过全细胞膜片钳技术测得的ASICs各亚型通道pH50在不同pH值上的分布情况为：pH 6.0 1a+1b，1b+3；pH 5.5 1a+2a；pH 5.0 1b+2a、1b+2a+3(4.9)、1a+2a+3(5.1)。本实验的结果提示可能参与呼吸中枢兴奋调节的ASICs亚型包括ASIC1或ASIC2。pH 5.0时家

24、兔呼吸频率达到峰值，提示呼吸中枢对氢离子的最适敏感值接近于pH5.0，有助于进一步推测参与呼吸调节机制的具体ASICs通道的亚基组成。在观察到呼吸频率的改变与pH值呈反向U型剂量关系后，是否H+兴奋呼吸活动的作用有ASICs的参与呢？根据ASICs均可被Amiloride所阻断的公认，如在离体细胞的实验中发现，当使用Amiloride后，可以有效降低氢离子所引起的细胞膜电位的改变1, 13。本实验中中枢微量注射Amiloride后发现，家兔呼吸中枢对氢离子浓度改变的兴奋性明显下降，说明Amiloride在整体动物的层面上也具有降低机体中枢对氢离子浓度改变的敏感性的作用，同时提示ASICs可能参

25、与氢离子引起呼吸中枢性兴奋的过程。在我们的实验中发现，Amiloride对呼吸频率的改变作用并不呈浓度依赖，可能是在低浓度组1mmol/L Amiloride时，对ASICs通道相应位点的阻断已达饱和。另外实验中发现，使用高浓度的Amiloride后，氢离子浓度改变所引起的膈神经放电积分面积有所增加，与呼吸频率的变化相反，提示可能Amiloride不同浓度的阻断作用对呼吸神经元起不同作用，引起呼吸中枢产生对呼吸频率或呼吸幅度的不同调节，值得进一步深入研究。在观察到ASICs参与H+改变调节呼吸活动后，我们试图分析ASICs参与过程中其上游的可能影响因素。已知MK-801可以阻断NMDA受体的开

26、放，从而抑制神经元细胞内Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinase II, CaMK）的活性。Jun Gao等14在缺血所致神经元损伤的大鼠模型中，利用免疫沉淀反应（IP）的研究中发现，使用MK-801后，因缺血所致ASIC1a通道的磷酸化的比率有显著降低。提示NMDA受体可能是ASICs上游，阻断NMDA受体使对应的特异ASICs通道因不能得到磷酸化而活性受到抑制。但是NMDA受体是否也参与ASICs对呼吸活动的调节呢？本实验中观察到，与pH5.0相比，高浓度组100mmol/L NMDA引起呼吸频率增加与pH 5.0时相比有明显

27、差异（P<0.05），而低浓度组10mmol/L NMDA的呼吸频率无明显改变，可能由于剂量过低所致。两个浓度组的MK-801的呼吸频率与pH5.0相比，有下降的趋势，但差异没有统计学意义（P>0.05），这可能是由于实验组样本数太少所致。实验中兴奋NMDA受体增加呼吸中枢对氢离子浓度改变的敏感性，而抑制NMDA受体则减弱呼吸中枢对氢离子浓度改变的敏感性，提示NMDA受体与ASICs之间存在一定关联（见图5的模式图）。侧脑室注射酸化人工脑脊液、ASICs阻断剂、NMDA受体激动剂与阻断剂对家兔的呼吸活动产生影响，主要表现在呼吸频率的改变；而膈神经的放电积分面积及对心率均无明显影响。

28、提示中枢ASICs的存在，以及ASICs主要参与H+改变对呼吸频率的调节。动脉血液、组织液或脑脊液中的O2、CO2、H+的改变通过化学感受性反射来调节呼吸活动。以往认为这些化学因素的改变直接刺激中枢和外周化学感受器，引起呼吸中枢的兴奋，现在通过ASICs的发现，证实了呼吸中枢对氢离子的敏感性还与ASICs有关，通过周围局部氢离子浓度的改变影响ASICs的活性，进而引起神经元细胞膜电位的改变，从而产生对呼吸活动的调节。Amiloride作为目前常用的ASICs阻断剂，并不具有相关通道亚型的特异性，开发ASICs特异的阻断剂，可以为研究ASICs参与生理与病理生理功能提供必要的条件。而通过阻断AS

29、ICs上游的NMDA-CaMKII磷酸化途径，可能使特异的ASICs亚基的活性受到抑制，从而为探寻ASICs参与氢离子所引起的呼吸中枢兴奋的调节机制提供更为有效的方法。参考文献1 Waldmann R, Champigny G, Bassilana F, et al. A proton-gated cation channel involved in acid-sensing J. Nature, 1997, 386(6621): 173-177.2 Ugawa S, Minami Y, Guo W, et al. Receptor that leaves a sour taste in th

30、e mouth J. Nature, 1998, 395(6702): 555-556.3 Price MP, Lewin GR, Mcllwrath SL, et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation J. Nature, 2000, 407(6807): 1007-1011.4 Chen CC, Zimmer A, Sun WH, et al. A role for ASIC3 in the modulation of high-intensity pain stimuli

31、J. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(13): 8992-8997.5 Wemmie JA, Chen J, Askwith CC, et al. The Acid-Activated Ion Channel ASIC Contributes to Synaptic Plasticity, Learning, and Memory J. Neuron, 2002, 34(3): 463-477.6 Wemmie JA, Coryell MW, Askwith CC, et al. Overexpression of acid-sensing ion channel 1

32、a in transgenic mice increases acquired fear-related behavior J. Proc Natl Acad Sci, 2004, 101(10): 3621-3626.7 Sutherland SP, Benson CJ, Adelman JP, et al. From the Cover: Acid-sensing ion channel 3 matches the acid-gated current in cardiac ischemia-sensing neurons J. Proc Natl Acad Sci, 2001, 98(2): 711-716.8 Sluka KA., Price MP, Breese NM, et al. Chronic hyperalgesia induced by repeated acid injections in muscle is abolished by the loss of ASIC3, but not ASIC1 J. Pain, 2003, 106(3): 229-239.9 Ettaiche