保鲜实验方案

1、保鲜实验第一部分 营养指标的测定1一般物理性状测定1.1果径 随机取10个果实，用游标卡尺测定其纵、横径，最后取其平均值。1.2果重 随机取10个果实，用电子天平测定其果重，最后取其平均值。1.3 可食率 随机取10个果实称重m，去除果肉后，再用电子天平精确称量核重m1，可食率/%=（m-m1）/m×100% 1.4含水量 取称量瓶，放入烘箱中以100-105烘干（至恒重），置干燥器中冷却，称重m0。称取2g果实，精确质量m。将果实和称量瓶放入烘箱中，于100-105烘2h。取出置于干燥器中冷却后称重m1。放回烘箱继续烘0.5 h，冷却称重m2，直至两次重量差不超过3mg为止。计算：

2、含水量/%=（m+ m0- m2）/ m×100% 1.5 可溶性固形物(TSS)阿贝折射仪 先用蒸馏水校正，取一滴汁液，用阿贝折光仪观察、读数，重复10次。2 营养品质的测定2.1 蛋白质含量的测定考马斯亮蓝法2.1.1原理 考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。2.1.2 试剂配制：100gmL标准蛋白质溶液的配制：称取10mg牛血清

3、白蛋白，用蒸馏水溶解并定容至100mL，现配现用。考马斯亮蓝G250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入85的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL，于4保存。（考马斯亮蓝称完后先加磷酸，然后用95%的酒精润洗量取磷酸的量桶，再用蒸馏水洗磷酸和酒精的量桶，最后用磁力搅拌器搅拌后定容。）2.1.3标准曲线的绘制：取5支具塞试管，按表1数据配制后盖塞，混匀反转混合数次，30 min后在595nm下比色。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。表1 管号蛋白质标准液（mL)蒸馏水（mL)蛋白质含量（g）考马斯亮蓝G250溶液（mL）102.0

4、0420.51.525431.01.050441.50.575452.0010042.1.4样品提取液测定：取1g果肉，研磨后用4层纱布过滤，定容到25mL。吸取2mL样品提取液，放入具塞试管中加入4mL考马斯亮蓝G250溶液，充分混合，放置30 min后在595nm下比色，记录吸光值，并根据线性方程式计算。2.2 有机酸的测定酸碱滴定法 2.2.1试剂配制0.1mol/LNaOH溶液配制：4gNaOH用蒸馏水溶解定容至1000mL。1%酚酞指示剂：称取1g酚酞，用95%溶解定容至100mL。2.2.2 操作 称取5g果肉研磨成匀浆，用少量蒸馏水将匀浆移入锥形瓶中， 7580水浴加热0.5h，

5、期间摇动数次，冷却后用4层纱布过滤，用蒸馏水定容至50mL。取滤液10mL于锥形瓶中，加入2滴1%酚酞指示剂。用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至淡粉色，持续30s不退色，记下NaOH溶液的体积。平行3次，取其平均值V。计算：有机酸/%= （V×C×192×50）/（m×10000） （3） 式中：V为样品消耗NaOH溶液滴定的体积（mL）；C为NaOH溶液的浓度（mol/L）；m为杨梅果肉的质量（g）。192为柠檬酸的换算系数2.3 VC含量的测定2,6-二氯酚靛酚滴定法2.3.1试剂配制2%草酸溶液的配制: 准确称取草酸10g，用蒸馏水定容至50

6、0mL。标准抗坏血酸溶液（0.2mg/mL）的配制:准确称取20mg纯抗坏血酸，溶于2%草酸溶液中，并定容至100mL，贮于棕色瓶中，冷藏，现配现用。2,6-二氯酚靛酚溶液的配制: 准确称取50mg 2,6-二氯酚靛酚溶于50mL的热水中，冷却后加水定容至250mL，贮于棕色瓶中冷藏（4），约可保存一周。每次使用之前，以标准抗坏血酸溶液标定。2.3.2实验步骤1) 2,6-二氯酚靛酚溶液的标定：准确吸取标准抗坏血酸溶液5mL置于锥形瓶中，加入5mL2%草酸，以2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持30s不褪色，即达到滴定终点（平行三次）。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少毫克抗坏血

7、酸。准确吸取10mL 2%草酸作空白对照，按上述方法滴定。2) 样品提取：称取5g果肉于研钵中，加入20mL 2%草酸，研磨成匀浆。用四层纱布过滤，纱布可用少量2%草酸洗涤几次，取其滤液，并定容至50mL。3) 样品滴定：准确吸取滤液三份，每份10mL，分别放入3个锥形瓶内，滴定方法同上。计算：1mL染料样相当于维生素C的量(mg/mL) T=C×V0V1-V2式中：c为抗坏血酸的浓度（0.2mg/mL）； V0为抗坏血酸的体积（5ml）； V1为滴定抗坏血酸所用染料的体积（mL）； V2为空白滴定所用染料的体积（mL）；式中：VA为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数； VB为滴定空白

8、对照所耗用的染料的平均毫升数； C为样品提取液的总毫升数；D为滴定时所取的样品提取液毫升数；T为1mL染料样相当于维生素C的量（mg/mL）；W为待测样品的重量（g）。第二部分 生理指标测定1 感官指标 记录果实贮藏期间的外观品质：包括果皮颜色、硬度、和腐烂率，好果率和失重率统计1.1好果率的测定好果率=(好果数/检查总果数)×100%。（注意：当烂斑面积大于1 cm2时，则认定该果实为腐烂果。）1.2硬度（硬度仪）：人工：4.15.0为较硬，3.14.0为硬，2.13.0为软，1.12.0为较软，01为很软。1.3失重率的测定：贮藏前称取果实重量m0，贮藏期间每次取固定的果实称重m

9、1，失重克数即为m0-m1；失重率=(m0-m1) /m0×100%。2质膜相对透性的测定 取果实5g，切碎称重m，放入烧杯中，加蒸馏水50mL，用电导率仪测定其电导值（L0），浸提10min再测电导值（L1），再将烧杯放置电炉上煮沸，冷却后测电导值（L2）.质膜相对透性(%)=( L1-L0)×100/(L2×m)。平行3次，最后求出平均值。2丙二醛（MDA）含量测定2.1 原理 丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕

10、色的三甲川(3，5，5三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收，因此测定植物组织中MDATBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。 2.2 试剂配制10%TCA（三氯乙酸）：50gTCA定容至500mL。（有腐蚀性）0.6% TBA（硫代巴比妥酸）：称取0.6gTBA，用0.1mol/LNaOH溶解，再用在10%TCA定容至100mL。2.3操作 称取果肉1g，加入2 mL l0% TCA(三氯乙酸)和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8 m

11、L TCA进一步研磨，用4层纱布过滤。吸取滤液3mL（对照加2mL蒸馏水），加入3mL 0.6% TBA溶液，混匀于沸水浴上反应15 min，迅速冷却后再离心4000r/min 10min。取上清液测定532、600和450nm波长下的吸光度。计算：MDA浓度C(mol/L )=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450，MDA含量（mol/g）= MDA浓度C(mol/L )×提取液体积(mL)/样品鲜重(g)3呼吸强度的测定：将红外二氧化碳分析仪的接口插入密闭容器的通气口，形成闭路循环，当仪器数字显示稳定时、时，记录容器内CO2含量C0(%)，取果实5个，称重，置密闭

12、容器中平衡1h，用红外二氧化碳分析仪测定密闭容器中CO2含量C（%）(读取仪器显示数字的最大值），根据测定结果计算其呼吸强度，结果以mg/（kg·h）表示。 (C- C0)×V×d×1000 样品呼吸速率（CO2 mg/kg·h) W×T 式中：C：果实呼吸后呼吸室中CO2浓度(%)；d：常温条件下的CO2的密度(g/cm3)；C0：未置果实时呼吸室中CO2浓度(%)；W：果实的重量(kg)；V：呼吸室的体积(cm3)；T：果实呼吸时间(h)。2酶活性测定2.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）2.1.1 原理 苯丙氨酸解氨酶（phenylal

13、anineammonialyase，PAL）催化苯丙氨酸的脱氨反应，使NH3释放出来形成反式肉桂酸。此酶的在植物体内次生物质（如木质素等）代谢中起重要作用。根据其产物，反式肉桂酸在290nm处吸光度的变化可以测定该酶的活性2.1.2 试剂配制0.1mol/L pH9.0硼酸缓冲液: 6.18g硼酸，加950mL H2O溶解，然后用1.0 mol/L NaOH调PH至9.0，补加H2O至1000mL即可使用。0.02mol/L苯丙氨酸溶液：称取0.3304gL-苯丙氨酸溶于100ml 0.1mol/L硼酸缓冲液中，pH9.0。2.1.3操作 称取果肉5g，加0.1g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、少许

14、石英砂，冰浴研磨成匀浆。加入5mL pH9.0硼酸缓冲液，4，12000r/min离心5min，上清液为酶粗提取液。取1mL酶粗提取液，加2mL 0.02mol/L苯丙氨酸溶液，加入2mL pH9.0硼酸缓冲液，室温反应30min，加入50L浓盐酸终止反应。每隔1min测定290nm处吸光值，共测4min。以吸光值变化0.01为1个酶活力单位U，酶活力表示为U/（min·g）。样品PAL活性U/(min*g）=(A*Vt)/(0.01V1*t*m)=（25*A）/（0.3*m）U:吸光值变化0.01为一个酶活力单位Vt：酶提取液总体积（ml）V1:测定时用酶提取液体积（ml）t:反应

15、时间（min）m:样品质量（g）2.2过氧化物酶(POD) 称取果肉5g，加0.1g PVP、少许石英砂，冰浴研磨成匀浆。加入5mL pH6.0磷酸缓冲液，4，12000r/min离心5min，上清液为酶粗提取液。取1mL酶粗提取液，加入4mL反应液（pH 6.0磷酸缓冲液50mL，体积分数30%过氧化氢28L，愈创木酚19L），室温反应30min，加入50L浓盐酸终止反应。每隔1min测定470nm处吸光值，共测4min，以吸光值变化0.01为1个酶活力单位U，酶活力表示为U/（min·g）。样品POD活性U/(min*g）=(A*Vt)/(0.01V1*t*m)=（25*A）/（

16、0.3*m）U:吸光值变化0.01为一个酶活力单位Vt：酶提取液总体积（ml）V1:测定时用酶提取液体积（ml）t:反应时间（min）m:样品质量（g）2.2.1原理 POD是植物体内普遍存在的、活性较高的一种氧化还原酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等生理过程和生化代谢过程都有密切关系，在果蔬生长发育、成熟衰老、病原菌感染、贮藏加工条件改变时，其活性不断发生变化。 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 2.2.2试剂配制 1、1/15 M、pH 6.0 磷酸

17、缓冲液（提取缓冲液）： A液：1/15 M Na2HPO4溶液，取2.3876 g Na2HPO4 溶解定容于100mL； B液：1/15 M NaH2PO4溶液，取20.801 g NaH2PO4溶解定容于1000mL； 取 A液100mL 与 B 液900mL摇匀混合。 2、0.1mmol/L、pH 5.5 醋酸-醋酸钠缓冲溶液： A液：0.2M 醋酸溶液：量取 11.55mL 冰醋酸，加蒸馏水稀释至 1000mL； B液： 0.2M 醋酸钠溶液：称取16.4g 无水醋酸钠（或27.2 g 三水合醋酸钠），加蒸馏水溶解后定容至 1000mL； 取68 mL A液与 432 mL B液混合，

18、调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。 3、0.08 H2O2溶液： 取 30过氧化氢 2.67ml 稀释到 100ml 混匀后即成母液，可放置于冰箱内保存3 天，临用时再从母液取 10ml 稀释到100ml 即为工作液； 4、 0.1 邻甲氧基酚溶液（愈创木酚）：取 0.1g 邻甲氧基酚溶于100ml 蒸馏水中；或配制 25mmol/L 愈创木酚溶液：取 320 微升愈创木酚，用 pH 5.0 醋酸缓冲溶液稀释至100mL。 2.2.4操作 粗酶液提取：取样品 1 克，加入适量 pH 6.0 磷酸缓冲液研磨成匀浆，转入25ml 容量瓶，用 pH 6.0 磷酸缓冲液定容至刻度，混匀，用

19、 4 层纱布过滤，滤液装入离心管中，于 4，8000rpm 离心 10min，收集上清即得粗酶液，冷藏保存。 酶活测量：把1ml pH 5.0 醋酸缓冲溶液、 1ml 粗酶液 （如酶活性过高可稀释） 、1ml 0.1邻甲氧基酚溶液加入到 10ml具塞刻度试管中，混匀，置于 30 水浴中 5 分钟左右，使其温度达到平衡，加入 1ml 0.08H2O2溶液，加入时立即开始计时，摇匀并迅速倒入比色皿于470nm比色，在反应1min时记录 OD 值。 参比液用1ml水代替0.08H2O2。 POD酶活性表示方式：以 OD 值直接表示其相对活性，单位为 OD470nm/min gFW 。 注意：加入过氧

20、化氢后要迅速比色，如不能在 1min时读数，可采用下列方式：在反应混合液中加入过氧化氢后后，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下的吸光度值，每隔 1min 读数一次，共记录4min。 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 O.D 470nm/min gFW表示之。 也可以用每 min 内O.D 470变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（u）表示。 过氧化物酶活性 u/g.min=OD470×VT W× Vs×0.01× t 式中： OD470反应时间内吸光度的变化。 W 样品重，g。 VT 提取酶液总体积， mL。 V

21、s 测定时取用酶液体积, mL。 t 反应时间，min2.3多酚氧化酶PPO称取果肉5g，加0.1g PVP、少许石英砂，冰浴研磨成匀浆。加入5mL pH6.8磷酸缓冲液，4，12000r/min离心5min，上清液即为酶粗提取液。取2mL pH6.8磷酸缓冲液、2mL的0.10mol/L儿茶酚溶液、1mL酶粗提液，室温反应30min，加入50L浓盐酸终止反应。每隔1min测定420nm处吸光值，共测4min，以吸光值变化0.01为1个酶活力单位U，酶活力表示为U/（min·g）。样品PPO活性U/(min*g）=(A*Vt)/(0.01V1*t*m)=（25*A）/（0.3*m）U

22、:吸光值变化0.01为一个酶活力单位Vt：酶提取液总体积（ml）V1:测定时用酶提取液体积（ml）t:反应时间（min）m:样品质量（g）2.3.1原理 多酚氧化酶是一种含酮的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化为醌，醌有颜色，可用分光光度计测量其吸光度变化测定多酚氧化酶活性，本实验以邻苯二酚为底物，其氧化产物在 420nm 具有最大光吸收。 2.3.2试剂配制pH6.0 磷酸缓冲液：同过氧化物酶活性测定中的配制方法。 0.2%邻苯二酚：称取 0.2g 邻苯二酚，溶于磷酸缓冲液，稀释到 100ml，装于棕色瓶，冷藏，备用。 2.3.3操作2.3.3.1酶液的制备 取果蔬样品5g（视样品酶活性而定），

23、用预冷的 pH6.0 磷酸缓冲液研磨，并定容 25ml，4 层纱布过滤，滤液离心（5000r/min、10min、4） ，上清即为粗酶液，5下保存，24 小时内分析完毕。 2.3.3.2PPO 酶活测定 将 4ml 0.2%邻苯二酚加入 10ml 具塞刻度试管中，在 30水浴平衡 10 分钟，加入 1ml 粗酶液计时并摇匀，立即于 420nm 波长处比色，在反应 15s 时开始记录 OD 值，作为初始值，然后每隔 1min 记录一次，连续测定，至少获取 6个点的数据。（重复 3 次取平均值） 参比液用1ml 蒸馏水代替酶液。 记录吸光值，制作 OD420随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分（

24、从时间I 到时间F）计算每分钟吸光度变化值OD420。 OD420= （OD420F- OD420I）/（tF -tI） 式中 OD420每分钟反应混合液吸光度变化值； OD420F反应混合液吸光度终止值； O.D420I反应混合液吸光度初始值； tF 反应终止时间，min； tI 反应初始时间，min。 以每克果蔬样品每分钟吸光度变化值增加 1 为 1 个活性单位，单位是OD420/min.g.计算公式： U=(OD420×V )/ (Vs×m) 式中 V样品提取液总体积，mL； Vs测定时所取样品提取液的体积，mL； m样品质量，g。 2.4过氧化氢酶CAT测定2.4.1 原理 H2O2在 240nm 波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反