CRISPRcas9

1、基因组改造新技术CRISPRCas系统 有一种细菌编码的酶能够利用向导RNA（guide RNA）分子对特定的DNA片段进行定向切割，科学家们利用这种特点开发出了一种能够对基因组进行特异性定点改造的工具，对细胞乃至整个生物体进行基因组改造。目前已经利用这种技术对细菌、人体细胞以及斑马鱼进行过成功的遗传学改造工作。日本大阪大学（Osaka University）的科研人员们曾经在1987年发表过一篇论文，不过这篇论文在当时并没有引起太多人的注意，只不过是一篇普普通通的小文章。这帮大阪大学的科学家当时正在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究，不过他们在

2、工作中发现，在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。关于这样一个重复序列他们当时在论文中是这样评价的“我们目前也不太清楚这些序列的生物学意义。”不过这个在差不多三十年之前取得的不起眼的“小发现”在今天却绽放出了耀眼的光芒，因为如今科学家们正是利用这个小片段找到了一种可以对多种生物的基因组进行遗传改造的工具，而且这种方法操作起来还非常地简单。就在短短的一个月之内，在包括科学（Science）和自然 生物技术（Nature Biotechnology）等杂志上就已经发表了5篇相关的论文介绍这个现在被称作

3、CRISPRCas系统（CRISPRCas systems）、简便而又实用的基因组改造新技术。近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes, Cas gene）。研究发现，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，说明这套C

4、RISPRCas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制，就好像是另外一套适应性免疫反应系统（adaptive immune system）。后续的遗传学试验和生物化学试验也证实了这种猜测。虽然有很多CRISPRCas系统需要多种蛋白的参与，但是在很多细菌的胞内都只需要一种内切酶（endonuclease）Cas9就足够了，我们将这种CRISPRCas系统也称作2型系统（type II systems），如图1所示。Cas9内切酶在向导RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割，不过主要识别的还是保守的间隔相邻基序（proto-spacer adjacent

5、motifs，PAM基序）。如果要形成一个有功能的DNA切割复合体，还需要另外两个RNA分子的帮助，它们就是CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA（trans -acting CRISPR RNA, tracrRNA)。不过最近有研究发现，这两种RNA可以被“改装”成一个向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）。这个sgRNA足以帮助Cas9内切酶对DNA进行定点切割。最新的报道称，在多种类型的细胞和生物体内，这种RNA介导的Cas9酶切作用能够正常地行使功能，在完整基因组上的特定位点完成切割反应。这样就可以方便地进行后续的基因组改造工作了。细胞

6、通常会通过两种方式对发生双链断裂的DNA进行修复，这两种方式分别是同源重组修复机制（homologous recombination, HR）和非同源末端连接修复机制（non-homologous end joining, NHEJ），不过在修复的过程中细胞有可能会对修复位点进行修饰，或者插入新的遗传信息。图1 RNA介导的Cas9系统定向基因组修饰作用机制示意图。Cas9内切酶是一种DNA内切酶，很多细菌都可以表达这种蛋白，Cas9内切酶能够为细菌提供一种防御机制，避免病毒或者质粒等外源DNA的侵入。Cas9内切酶必须在向导RNA分子的引导下对DNA进行切割，这是因为这些向导RNA分子含有与

7、靶DNA序列互补的序列，我们称之为PAM序列。Cas9内切酶在向导RNA分子的引导下对特定位点的DNA进行切割，形成双链DNA缺口，然后细胞会借助同源重组机制（homologous recombination）或者非同源末端连接机制（non-homologous end joining）对断裂的DNA进行修复。如果细胞通过同源重组机制进行修复，会用另外一段DNA片段填补断裂的DNA缺口，因而会引入一段“新的”遗传信息。最近有多项研究都表明，RNA介导的Cas9系统可以被用于对人类和小鼠细胞，以及细菌或斑马鱼胚胎进行基因组改造的工作当中。Cong、Mali和Cho这三个课题组开展的多项研究都表明

8、这种RNA介导的Cas9系统在人类细胞当中同样能够正常的发挥作用。研究发现，对化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）编码的Cas9内切酶进行改造之后也可以让它们在人类细胞的细胞核中被活化，然后再搭配针对人体DNA序列设计的大约20bp长的双RNA复合体或者sgRNA，就可以对人体基因组进行定点切割和改造。科研人员们在多种人体细胞（其中还包括了诱导多能干细胞）内共表达了这种专用于人体的Cas9内切酶和向导RNA，结果都在预定的DNA位点观察到了基因组双链DNA切割，以及后续的修复现象，成功率高达38%，而且还发现这种Cas9内切酶对细胞几乎没有毒性。这套Cas9系统还能够在

9、人体细胞内以非常高的效率对普通的基因组位点进行定向基因替换（targeted gene replacement）的操作。在Jinek等人于同期发表的另外一篇论文中，他们发现这套RNA介导的Cas9系统还能够在人体细胞内诱发位点特异性的基因组修饰动作（site-specific genome modifications），而且他们还发现Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤。之前的研究发现，细胞更倾向于使用同源重组机制对单链DNA损伤（single-stranded DNA breaks）进行修复，因此引入的突变也会更少，Mali和Cong等人也对各

10、种不同的、只能够形成单链DNA断裂的Cas9内切酶进行了试验。结果发现这些突变的Cas9内切酶在细胞内引发NHEJ修复的机率的确更低，但是它们在引发基因替换（这主要是借助同源重组修复机制）的效率方面与野生型的Cas9内切酶不相上下。Mali和Cong这两个课题组还发现这套Cas9系统具有多重靶向功能（multiplexed targeting），这些Cas9内切酶能够与基因组中两个不同的序列（位点）结合，形成多处断裂。此外，Cong等人还发现如果分别表达tracrRNA和crRNA，还可以进一步提高切割的效率。这一发现表明，如果进一步改进sgRNA的设计方案，使其更接近双RNA复合体的结构，将

11、会进一步提高Cas9系统的基因组编辑效率。除了这些细胞学的研究成果之外，科学家们还发现这套Cas9系统对于生物体同样有效，一样可以对生物体进行基因组改造的操作。Jiang等人发现，在细菌内表达多种向导RNA之后，Cas9内切酶可以对细菌基因组的多个位点进行修饰操作。借助这一技术可以对各种微生物进行遗传学改造，打造出符合我们人类需要的工程微生物，使其造福人类，在生物能源或者生物制药等诸多领域具有极大的应用潜力。Hwang等人则使用单细胞斑马鱼胚胎（one-cell-stage embryos）进行了试验，他们将编码Cas9蛋白的mRNA和特定的向导RNA（与斑马鱼基因组DNA的匹配机率高达245

12、9%）注射到斑马鱼胚胎内，结果取得了成功，在所有被注射的斑马鱼胚胎内，10个切割位点中有8个位点都发生了切割，并且引入了插入或者缺失突变。这一试验结果表明，RNA介导的Cas9切割活性完全可以应用于生物体水平，哺乳动物和植物都可以使用这种技术进行遗传学改造。目前最有价值的应用应该就是使用这种技术为各种人类疾病构建出动物模型。这种基因组改造技术还可以被应用于合成生物学（synthetic biology）、基因定向干扰或者多重基因干扰（即基因网络干扰）和基因治疗等领域。接下来的研究难点应该就是如何克服脱靶效应（off-target effect），如何提高基因组改造的效率和特异性，以及如何将这项

13、技术应用于更多的物种等方面。所以我们也需要对这种Cas9平台与其它的基因组改造技术，比如巨核酶技术（meganucleases）、锌指核酶技术（zinc-finger nucleases）以及TALEN（transcription activator-like effector nuclease）技术等进行深入和全面的对比。除了在基因组改造方面的应用之外，使用Cas9平台还可以进行基因沉默等方面的操作（比如使Cas9蛋白失活），或者赋予Cas9蛋白更多新的功能（比如使其具有转录因子样的转录活性等）。其实除了这种Cas9系统之外，细菌还为我们贡献了很多其它的工具，比如限制性内切酶（restric

14、tion enzymes）、热稳定的聚合酶（thermostable polymerase）等，极大促进了分子生物学的发展。下面，让我们一起期待Cas9技术在生物技术和医学等诸多生物学领域里创造出更多的奇迹吧。作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。

15、因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。1 CRISPR/Cas (CRISPR associated) systems： CRISPR/Cas系统（CRISPR相关系统）， CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat）即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌（archaea）胞内起到了一种获得性免疫（acquired immunity）的作用。CRISPR系统主要依赖crRNA和tr

16、acrRNA来对外源DNA进行序列特异性降解。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中在2型系统（type II systems）中依赖的是Cas9蛋白。在RNA的介导下，Cas9蛋白能够对crRNAtracrRNA识别的靶序列进行切割。 crRNA：CRISPR RNA能够与tracrRNA配对，形成双链RNA结构，这种双链RNA分子能够介导Cas9核酸内切酶对与双链RNA分子互补结合的DNA序列进行切割。 此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRN

17、A/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以

18、上。2 2013 年 1 月份，美国两个实验室在Science杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。2 CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打