Agilent+1260+高效液相色谱仪使用维护保养操作规则

1、文件名称文件编制及管理规程颁发部门研究所文件编号页码第 5 页 共 6 页文件名称文件编制及管理规程文件编号 颁发部门研究所替代生效日期起草人审核人批准人起草日期审核日期批准日期优胜美特制药有限公司&浙江巨泰药业有限公司-药物研究所-变更内容及定期审核版本号生效日期变更项目, 简述修订原因及内容00010203定期审核分发部门/人员部门/人员份数分发号一、目的 制定Agilent 1260型高效液相色谱仪操作维护规程，使操作维护规范化，保证检测结果准确可靠。二、适用范围 本规程适用于Agilent 1260型高效液相色谱仪的操作维护。三、职责 QC对本规程的实施负责，项目主管、研发总监

2、对本规程实施进行监督。四、程序内容4.1仪器配置 本仪器由梯度泵，自动进样器，柱温箱，VWD检测器或DAD检测器和操作软件工作站组成。4.2操作前的准备4.2.1流动相的制备 用色谱纯的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水为新鲜制备的重蒸馏水。对规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节，配制好的流动相应通过0.45m以下的滤膜滤过，用前脱气，应配制足量的流动相。4.2.2 供试溶液的配制 供试品用规定溶剂配成供试溶液。定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45m以下的滤膜滤过，必要时，在配制供试溶液前，样品需

3、经提取净化，以免对色谱系统产生污染。4.2.3 检查上次使用记录和仪器状态，检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。4.3仪器的操作4.3.1 接通电源，打开计算机及工作站其他各部件开关，约30秒后，各部件进入待机状态，指示灯为橘黄色，启动完成。4.3.2用鼠标双击企业仪器启动程序界面上的Agilent1260仪器图标进入Agilent1260 LC在线色谱工作站，该页面主要由以下几个部分组成：4.3.2.1最上方为命令栏，依次为文件,控制,方法，

4、分析，序列，数据等；4.3.2.2命令栏下方为快捷操作图标，如多个样品连续进行分析、新建方法序列、单个样品分析、调用文件、保存文件等；4.3.2.3左部有五栏从上到下依次为方法，序列，报告，控制，视图五栏。4.3.2.3.1用鼠标单击【方法】栏进入仪器方法界面，有仪器设置、积分事件、前处理、手动积分修正、平铺显示等。下面介绍以上部分方法的功能。4.3.2.3.1.1仪器设置：控制运行样品时各部分组件满足的要求，如柱式加热炉的温度.梯度泵的流速，溶剂比例，停止时间，压力限值。检测器的检测波长。自动进样器的进样量。辅助图谱的记录等。4.3.2.3.1.2积分事件：用于样品的积分，有很多参数控制样品

5、的积分，如阈值、最小面积、宽度、积分关闭等。4.3.2.3.1.3用鼠标单击【序列】栏进入序列编辑界面。4.3.2.3.1.4用鼠标单击【报告】栏进入建立报告界面，有归一化，面积百分比，内标法，外标法等报告格式。4.3.2.3.1.5用鼠标单击【控制】栏进入仪器控制界面，有仪器设置，运行队列，仪器状态三项。下面介绍以上三项的控制功能。4.3.2.3.1.5.1仪器设置：控制运行样品时各部分组件满足的要求，如柱式加热炉的温度.梯度泵的流速，溶剂比例，停止时间，压力限值。检测器的检测波长。自动进样器的进样量。辅助图谱的记录等。4.3.2.3.1.5.2运行队列：控制样品运行的顺序。也是提交单针和序

6、列的界面，下面介绍提交样品运行的方法。在运行队列界面上单击鼠标右键出现单次运行/单次分析，序列运行/序列分析等栏，提交单次运行需单击右键后停留在单次运行项后单击鼠标左键，出现单次运行对话框，出现以下几栏，样品ID（样品名称），方法，数据路径，数据文件（数据名称），样品瓶等，单击方法图标，调用已保存在系统内运行样品的方法（即以上介绍的仪器设置），单击数据路径图标将数据保存在你可找到的文件夹内，将数据文件命名，设置好分析对应进样盘的样品瓶后，即可以提交即将要分析的样品了，优先提交即走完当前样品后第一针样品。区别：手动提交每次做样之前必须给出新名字，否则仪器会将上次的数据覆盖掉。4.3.2.3.1.

7、5.3仪器状态：体现仪器运行/预运行/空闲时的状态。单击仪器状态一栏，从左至右依次是自动进样器梯度泵柱温箱检测器的状态，橘黄色为未就绪状态，绿色为空闲状态，粉色为进样状态，蓝色为运行状态，红色为出错状态。4.3.2.3.1.5.3.1自动进样器：是系统提交的提取规定位置的样品瓶的执行者，也是吸取样品瓶中定量的样品的操作者。4.3.2.3.1.5.3.2梯度泵：体现流动相的流动速度和整个系统的压力，A、B两相的比例。4.3.2.3.1.5.3.3柱温箱：体现色谱柱所在柱温箱的温度。4.3.2.3.1.5.3.4检测器：体现样品运行时的检测波长。4.3.2.3.1.6用鼠标单击【视图】栏出现数据显

8、示，数据，平铺显示三项。4.3.2.3.1.6.1数据显示下有显示所有数据，平铺数据，重叠数据，在线信号等。显示所有数据：即打开运行样品时所有记录运行状态的数据图谱。平铺数据：即将所有运行状态图谱平铺。重叠数据：即将所有运行状态图谱重叠。4.3.2.3.1.6.2数据下有手动积分修正，基线检查状态。4.3.2.3.1.6.3平铺显示下有样品录入。4.3.2.3.1.7视图下还有一栏：即控制左部五栏的出现和隐藏。4.3.2.3.1.8最下面一栏为手动积分修正一栏，出现很多操作图标，如积分关闭、分割峰、定义单峰、手动峰等。4.4色谱条件的设定及数据采集操作过程4.4.1从化学工作站菜单的仪器状态的

9、启动系统，也可点击桌面左下方上的接通系统电源按钮，还可以点击每一模块图标中的控制来开或关。把泵上的Purge阀逆时针松开，调流速为3.0ml/min,启动泵，系统开始排气泡，直到管线内（由容器瓶到泵出口）无气泡为止，切换通道继续Purge，直到所用流动相通道中无气泡为止，调流速为1.0ml/min，再把Purge阀顺时针旋紧。4.4.2流动相设置：单击泵左面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积，也可输入阻止分析和关泵的流动相体积底限，单击确定。4.4.3进样及方法的设定: 4.4.3.1点击化学工作站菜单的方法中新建方法。4.4.3.2 柱温箱参数设定：在温度下面的方框内输入温度，选中“与泵和

10、进样器一致”使柱温箱温度一致，单击确定进入下一画面。4.4.3.3泵参数设定：在流速处输入流量，在溶剂 B处输入另一溶剂体积百分比(A=100-B)，也可插入一行时间表编辑梯度，在“最大压力限度”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子，单击确定进入下一画面。4.4.3.4 VWD检测器参数的设定在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长，如254nm，在“峰宽（响应时间）”下方点击下拉成三角框，选择合适的响应时间，如0.1min（2秒响应时间）。点击确定进入下一画面。4.4.3.5自动进样器参数设定：在进样量输入进样量，选择洗针进样,输入洗针瓶位置，单击确定进入下一画面。4.4.3.6 DAD检测器

11、参数的设定参数设定 检测波长：一般选择最大吸收处的波长，最多可同时检测8个波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，通常情况下用100nm作为缺省值。可以根据所需保存光谱图的张数最多同时设定5个通道采集信号，无需采集光谱时应将“存储”设在“无”，若做峰纯度检测或优化求知的样品检测条件，建议选择“全部”。峰宽（响应时间）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。狭缝：窄时，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。根据检测波长选择氘灯或钨灯。4.4.3.7 单击“方法”菜单，

12、选中“方法另存为”，输入一方法名。如“test”，单击确定。4.4.3.8 从菜单视图中选出在线信号，选中信号窗口1，然后单击改变按钮，将所要绘图的信号移到右边的框中，点击确定。（如同时检测两个信号，则重复1、2，选中信号窗口24.4.3.9自动进样序列设定：在系统内保存即提交序列的方法，单击文件下拉菜单中序列并找到序列向导，选择已保存在系统中的仪器设置方法，单击确定进入下一对话框，输入样品信息：样品总体名称，数据路径中为将数据保存在规定文件夹中，在样品名称项中输入样品名称，未知样品运行次数项中输入样品瓶数，在每次运行重复次数输入进样针数，单击确定进入下一对话框，在样品瓶项中输入第一个样品瓶的

13、位置，在样品架上放入样品瓶，在进样量选项中选择使用方法，然后单击确定。出现一个有样品瓶数的序列，将每一个样品名称都区别开来，以防保存数据时将相同名称的数据覆盖掉，将序列保存在规定文件夹中，在运行队列中进行提交。4.4.3.10 等仪器ready，基线平稳，从运行控制菜单选择运行序列进样。4.4.4采样进程中可进行的操作4.4.4.1当出峰时间超过设定的分析停止时间时，可以点击右下部的工作参数“停止时间”进行适当的调整，可使主峰出完并与使杂质峰出完。4.4.4.2中止采集4.6图谱数据的处理4.4.5从文件命令栏中选择打开文件选项，选中你要的数据文件名，单击确定。4.4.6从方法菜单中，单击积分

14、事件进入积分参数画面。进行修改积分参数后在命令栏内选择分析。4.4.7将图谱优化，选择自定义报告进入报告编辑。可将谱图设置在任何量程区域内，也可以将谱图调节成任何颜色，在数据结果中单击鼠标右键选择报告属性将需要的积分参数选入，如理论塔板数，分离度等。在报告结果中就会出现应保存的结果。4.4.8打印报告：在打印报告之前，要将此方法保存后在报告菜单中选择 打印报告，将打印机的型号选择对，则报告已打印出来。4.5关机操作4.5.1清洗柱和流路：反相色谱系统先用10%甲醇水以1ml/min冲洗20min以上（如流动相中没有盐可直接用甲醇冲洗）再用甲醇冲洗15min。如果流动相中有盐先用10%乙腈水以1

15、.0ml/min冲洗60min以上，再用乙腈冲洗20min,甲醇冲洗20min。4.5.2清洗完成后，先将流速降到0，先关闭工作站，再依次关闭仪器各部件开关，断开电源。4.5.3填写仪器使用记录。4.6 注意事项：4.6.1流动相必须用色谱纯的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45m或更细的膜过滤)。 4.6.2 流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。4.6.3 不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4.6.4 长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。4.6.5

16、 每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。4.6.6 C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。4.6.7 堵塞导致压力太大，按预柱混合器中的过滤器管路过滤器单向阀检查 并清洗。清洗方法；以异丙醇作溶剂冲洗：放在异丙醇中间用超声波清洗；用10稀硝酸清洗。4.6.8 气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。4.6.9 要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。4.6.10更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。4.6.11 无论是否使用缓冲盐，都要配制90%水+10%异丙醇，在线仪器下拉菜单更多泵项下泵控制设置用于泵密封垫清洗的泵，选择定期清洗（包括周期和持续时间）或单次清洗，点击确定，注意溶剂不能干涸。4.6.12 泵头不可用超声清洗（可用乙醇、水清洗）、宝石杆不可超声，石英窗可用超声清洗。4.6.13溶剂过滤头不可超声清洗，可用35%硝酸浸泡1小时后再用溶剂清洗。4.6.14开机脱气前需观察真空脱气机状态，直至状态灯熄灭，说明可以正常工作，方可脱气。设定脱气流速不得过5ml/min！4.6.15缓冲盐严禁在流路中静置过夜