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1、脂蛋白分类检测系统低密度脂蛋白检测试剂盒英文用途和适用范围Quantimetrix公司的脂蛋白分类检测系统低密度脂蛋白试剂盒，是设计用来检测血浆或血清中浓度大于100mg/dl的总胆固醇值（脂蛋白成分包括极低密度脂蛋白到高密度脂蛋白）。脂蛋白胆固醇测量值用作评估脂分解代谢辅助手段，当和其他脂测试方法结合使用时，可用于病人风险评估和临床诊断。试验总结和解释血浆脂蛋白是用于运输胆固醇、三酰甘油和磷脂的球状颗粒。主要有五种脂蛋白：乳糜微粒、极低密度脂蛋白、中密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。低HDL胆固醇是冠心病的独立的强预兆。LDL胆固醇增高被认为是冠心病主要危险因素。众所周知，脂蛋白种类多

2、样，由多种适合颗粒大小、密度的化学成分组成。脂蛋白的异质性已经被多种分析手段演示，例如密度梯度离心、核磁共振、梯度凝胶电脉技术和脂蛋白分类检测系统，一个线性的、聚丙烯酰胺电泳系统。 低密度脂蛋白在脂蛋白检测系统中可能分解成最多7种LDL成分。LDL成分按照组成颗粒从大到小，分别命名为LDL-1到LDL-7。 受试者LDL异质性水平的不同是受基因和环境因素影响的。年龄、性别和脂质情况是常见的影响LDL组分因素。个体所展示出的脂蛋白概况，主要由认定为模式A的浮力大的LDL-1和LDL-2组分构成，相对地，较小的和较密集的成分（LDL-3到LDL-7）被认定为“模式B”。 奥斯汀关于109名心肌梗死

3、患者的研究表明，LDL的模式B成分与心肌梗死风险增加三倍有关，不受性别、年龄和相对体重的支配。Krauss报告有相似发现，Rajman的在标准三酰甘油的人中的研究也就低密度脂蛋白组分与风险因素的关系作报告。测试原则脂蛋白检测系统试剂盒组成在试管中预制聚丙烯酰胺凝胶加有亲脂染料的上样液态凝胶缓冲盐染料与每个脂蛋白中相应胆固醇的数量成比例结合。预染的脂蛋白随后经过电泳。在电泳第一相中，脂蛋白颗粒集中于上样胶和浓缩胶的一条窄条带中。当脂蛋白颗粒在分离胶基质中流动时，由于凝胶的吸引力，它们的颗粒按照从最大到最小排列，溶解于脂蛋白条带中：HDL移动最快，其次是较小的、大浮力的LDL、中间条带（基本由ID

4、L组成）和VLDL。乳糜微粒如果存在，将在浓缩胶中出现或存在于上样胶中。典型的脂蛋白分类检测轮廓由VLDL条带、中间条带、直到LDL条带和HDL条带。电泳完成后，在样本中出现的多种染色的脂蛋白片段（条带）通过用VLDL作为起始参考点（VLDL=0）和HDL（HDL=1）作为主要参考点进行鉴定。每种脂蛋白条带相关区域胆固醇含量是由mg/dl的样本中总胆固醇浓度定量决定的。样本中总胆固醇浓度需要独立测量，例如，临床用分析仪或一种保健仪器（a point of care instrument）。产品说明低密度会蛋白试剂盒由预制的高分辨的聚丙烯酰胺凝胶管，含有亲脂性燃料的上样胶液和缓冲盐。仪器和材料（

5、提供的，看Quantimetrix参考目录第48-7002）100次测试的试剂盒组成（a 100 test kit consist of）1.低密度脂蛋白脂印胶管 100管聚丙烯酰胺、缓冲、防腐剂2.LDL脂印上样胶（the loading jel）丙烯酰胺N，N-亚甲基双丙烯酰胺亲脂性染料催化剂稳定剂缓冲剂3.LDL脂印缓冲盐（羟甲基）三氨基甲烷硼酸4.LDL脂印产品嵌件脂印系统（没有提供的，看Quantimetrix目录第48-9150） 电脑（包括脂制品分析程序） 彩印机 数据扫描机 电泳槽 电源（120v/220v） 准备灯 准备架 煮沸的工具Liposure-脂蛋白控制（不提供，看Q

6、uantimetrix目录第48-7060-水平1）材料要求（不提供）1. 蒸馏或去离子水2. 25ul移液枪3. 200ul移液枪4. 电磁搅拌器5. 封口膜6. 量筒回收的试剂电解质缓冲液回收通过结晶一整瓶1200ml蒸馏或去离子水中的LDL脂印检测试剂盒缓冲盐。存储与稳定性胶管，上样胶和缓冲盐应置于2-8摄氏度中保存。不要冷冻。适当保存的试剂不论敞开还是密闭，在保质期前都是稳定的。注意事项仅用于体外诊断。LDL试剂盒只能按照嵌入指令使用。上样胶液包含皮肤接触和吞咽有毒的丙烯酰胺。避免吸入和长时间暴露上样胶液。上样胶液是光敏感的，并且存于琥珀色玻璃瓶中。避免用嘴吸液和任何与试剂或样本的身体

7、接触。所有样本，试剂和控制装置由于通过长时间皮肤接触摄取或吸收应该作为潜在传染源处理。注意，当它们用于你的实验室，应该习惯总是管理和清理材料。样本和采样只有空腹（12小时）样本能用血清或EDTA血清可能能用（看p15）不用肝素作为抗凝剂。样品可以在2-8摄氏度下保留7天。不建议冷冻样本。然而，如果样本需要冷冻应该低温冷冻（-70摄氏度及以下）化验步骤1. 准备电解质缓冲液，如前所述，通过结晶一整瓶1200ml蒸馏或去离子水中的缓冲盐。2. 从广口瓶中移出胶管，擦干净并空竖着它们放置于准备架中。避免碰触胶管底部或施加任何压力与胶管上，因为这将导致空气泡引入胶中。如果内部有空气泡或突起就不用胶管。

8、3. 从胶顶部完全移出储存的胶通过倒转晃动架子，如果必要，为了从管中移出过量缓冲可以在倒置时从管底吸出。4. 每管用25ul样品。5. 每管加200ul脂印上样胶。6. 放一条装封口膜在胶管和准备架盖之间避免污染。通过倒置几次准备架混合上样胶和样品。7. 设置准备灯上端灯泡垂直。放上装有东西的准备架使上样胶接触灯泡。上样胶光聚合30分钟（但是不超过40分钟）。8. 光聚合完成后，从准备架上移出胶管并小心插入硅适配器或上气室。侧面握住胶管，推至管底部上样胶与适配器上部平齐。湿润胶管顶部使容易插入。在这一步避免接触任一管的底部。如果剩下少于一整气室，由于这个目的为空适配器供小玻璃管插入。从顶部推管

9、直到流入适配器的低端。9. 在气室下端中放入1000ul电泳缓冲液，在气室上端中放入200ul。较低的缓冲可重复利用该5次。在气室上端只用新配的缓冲。缓冲液必须处于室温下。（18-27摄氏度）10. 所有气室组装和充满缓冲后，彻底检查每一管中的气泡。用吸管尖端驱出气泡。气泡可能阻碍电流的流通。11. 在适当的位置放电泳室盖并接上电源。调整电源至每胶管给予3mA电流（例如，12管36mA，6管18mA等）。电压应该设置为最大给予量（500V）。12. 电泳时间大约为60分钟。当HDL分子离最快迁移胶管底部1cm时停止电泳。13. 当完成电泳，关闭电源，移出气室盖并丢掉气室上端的电泳缓冲液。下端的

10、缓冲液可以保留并重复使用5次。7天后丢掉。14. 在电泳气室移出胶管之前，擦掉多余缓冲液，接着放到准备架上送入扫描机分析。在扫描之前允许胶管静置至少30分钟但不超过2小时。程序注解：分离胶表面扭曲并且VLDL条带可能在电泳期间出现。在胶从电泳移出后，通过小心的从上样胶上端、沿着玻璃引入rimming工具可以矫正扭曲。沿着分离胶的表面做圆周运动。胶会恢复它的正常形状。当撤出工具时避免移出上样胶（用蒸馏/去离子水充满胶空出的位置。）质量控制测试结果的可靠性通常用适当的模仿患者样本的表现来质控。建议每次患者样本用质量质控。质控只作为准确度和精确度的监视器。适当范围内的控制数值回复应该是有效分析性能表

11、现的标准。质控应该与当地、洲和联邦的规定 或评审要求表现一致。来自Quantimetrix公司，liposue，是一个适当的控制材料。定性结果注解：一个脂印文件的多种条带可以用脂印模板的质量评估来分辨。（均匀的LDL分布/非均匀的分布）。脂蛋白文件反映了患者样本的脂质状况。一个正常脂蛋白文件（模式A）将典型展示出VLDL的条带;中等条带C、B和A（这些包含IDL）；LDL-1、2和HDL。额外LDL分子的存在是不均一LDL的迹象。（例如，模式B）。（5个均匀的LDL分子样品中的脂蛋白分子从左至右逐渐的不均匀）用脂印模板LDL脂印系统模板用于分辨出现在胶中的均匀的脂蛋白分子。1. 用记号笔在玻璃

12、管标记每条脂蛋白表面。2. 使分离胶顶端VLDL分子与模板上标记“VLDL”的线排成一行。3. 沿模板使胶滑下直到HDL条带与标记为“HDL”的线重叠。4. 通过使胶上的条带与模板上相应的线相配确定样本表面上的脂蛋白分子。数值结果注解：在出现数值结果之前，一个总胆固醇数值对于每个要分析样品来说 ，必须包括应用临床支持的胆固醇方法。样品中总胆固醇浓度必须100mg/dl。扫描的胶管和每个脂蛋白分子的相关区域通过在每个条带预先的界限的范围内滴落的垂直线确定。胆固醇的数量为在每个脂蛋白中通过计算样品中每个条带相关区域总胆固醇得到的和。LDL胆固醇分别计算所有LDL分子包括中等条带A、B和C的胆固醇浓

13、度总量。照惯例，根据LDL颗粒的平均大小把脂蛋白分子文件分类为A类（正常）和B类（不正常）。一个正常的主要地包含大LDL（LDL-1和LDL-2）脂印文件与A类一致。一个不正常的主要地包含小LDL（LDL-3到LDL-7）脂印文件与B类一致，在文献中有描述。局限LDL脂印测试应该与其他数据一起使用（例如，额外的临床测试，身体检查，家庭历史等）。肝素干扰LDL分子的分离。样品中总胆固醇必须大于100mg/dl以避免高估VLDL胆固醇。样品中乳糜微粒将使胆固醇分子测量无效。样品外观（例如，模糊、浑浊或在样本上端有脂层）在过夜冷藏后应该用于确定乳糜微粒存在的测试。在怀孕期间脂印结果不能评估脂蛋白测试

14、。NCEP没有发布LDL分子的最佳的/合适的数值。预期值HDL-C和LDL-C国家胆固醇教育技术没有建立LDL胆固醇和HDL胆固醇风险相关定点。这些在2001年4月通过在NCEP成人治疗小组第三次报告上强调。分子 范围 状况HDL-C 40 mg/dl 在较高水平风险减少 40 mg/dl 风险增加LDL-C 100 mg/Dl 对冠心病人（CHD）最理想 130 mg/dl 合适 130-159 mg/dl 高危界限 160 mg/dl 高危LDL-C包括所有直径大于1.006至1.063kg/L脂蛋白颗粒，例如残存的VLDL、IDL、LP（a）和LDL。这些颗粒相当于中等条带和LDL分子通

15、过脂印系统分解的总量。胆固醇分子在脂印系统中的独立分子期望正常值建立如下：自我声明健康个体，雇佣的N=273（年龄19至85岁，166名女性和107名男性，47%白种人，18%西班牙人，16%亚洲人，5%黑人和14%未经宣布）。这些志愿者被要求空腹12小时。所有血液静脉穿刺收集入血清管中。血清样本接着用于测试脂质参数并用LDL脂印系统生成脂蛋白文件。把糖尿病、个体吃降低脂质的药物和那些近期心脏病发的列入除去标准。除此以外，怀孕女性由于她们脂质状况的改变从试验中除去。只有样本在理想的脂质状态符合NCEP指导方针，也就是TC200mg/dl、LDL130mg/dl、HDL40mg/dl，并且三酰甘

16、油150mg/dl用于确定期望数值。正常数值，N=144（年龄18到84岁，32%男性和68%女性）用于建立期望正常数值，在LDL脂印系统得到的每个脂质参数定义95%的置信区间。（样本数值显示相应的分数）建议每个实验室建立自己的正常范围，它可能服务于独一无二的群体，取决于地理、患者或环境因素。NCEP团体以外的人口数据， N=144（年龄18至77岁，46%男性和54%女性）在表2中显示。特定的性能特征精密度为了区间之间和区间内可变性测试四个样本。低、中、高HDL-C和LDL-C样品的选择：样品1：低LDL-C、高HDL-C和均匀的LDL模式（仅LDL-1和2）样品2：中LDL-C、中HDL-

17、C和稍微分散的LDL模式（LDL-1、2、3）样品3：高LDL、低HDL和分散的LDL模式（LDL-1、2、3和4）样品4：高 LDL-C、中间的HDL-C和分散的LDL模式（LDL-1到7）区间内精密度样品测试复制的12（电泳室最大容积）。表3中显示HDL-C、LDL-C（中等条带C、B、A和LDL分子）和VLDL-C精确结果 。区间外精确度四个样品测试一式两份，5天每天两次，在4电泳室用一个很大的胶管。在表6-8中显示区间外相应的精确结果。线性关系线性关系研究为两份超度离心分离加强的HDL-C或LDL-C血清样本。用人生理血清白蛋白液准备系列稀释。观察总LDL-C、HDL-C和VLDL-C

18、的浓度与期望值比较。如下计算回收率 ：%回收=（观察值/预期值）*100.剂量效应血清样本A（包含各种各样的分子）与等量样本B（包括主要的LDL-2）混合成AB。样本用脂印系统分析，决定了个别分子胆固醇浓度并且比较了观察值与期望值。同样地，血清样本A（包含各种各样的分子）与等量样本C（包括主要的LDL-1）混合成AC。样本用脂印系统分析，并且决定了个别分子胆固醇浓度而且比较了观察值与期望值。灵敏度 脂印系统的灵敏度定义为能够检测出的HDL-C和全LDL-C最低浓度。It was determined as the intersection of the lower 95 confidence

19、interval of the mean with x-axis when plotting a dilution series of expected vs. actual values for the individual lipoprotein parameters:VLDL灵敏性2.02mg/dl，HDL灵敏性3.65mg/dl，总LDL灵敏性为8.30mg/dl。干扰因素血清样本中的潜在干扰化学物质在表14列出浓度并且接着测试不理想的样本（4复制）。血红蛋白在浓度大于200mg/dl并且在肝素化血清收集管中找到的标准浓度肝素被发现干扰脂印测试。血清与血浆比较来自37位患者的血清和EDTA血浆样本在脂印系统中