β-地中海贫血基因检测标准操作规程(20110628)

1、某医院检验科发布日期:/版本/版次： A/0修订日期 ：修订次数: 0-地中海贫血基因检测标准操作规程文件编号： 页 数： 第 9 页 共 9 页某医院检验科作业指导书WORK INSTRUCTOR标题：-地中海贫血基因检测标准操作规程文件编号：发布日期：版本号： 版是否受控：编写：日期：审核：日期：批准：日期：序号修改条款 号修改内容修改人批准人修改日期-地中海贫血基因检测标准操作规程1 原理采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术：。2 器材2.1 试剂2.1.1 全血基因组提取试剂：深圳亚能全血DNA快速提取试剂盒（25人份/盒）。组成组分保存条件说明试剂盒裂红液室温保

2、存变性液B中含有固体成分，使用前应充分摇匀。变性液B洗涤液I洗涤液II试剂盒变性液A28保存冷藏溶解液有效期：1年。2.1.2 亚能-地中海贫血基因诊断试剂盒（25人份/盒）。主要组成：组成成分数量规格试剂盒PCR 反应液25管23mL试剂盒膜条25张POD母液1管75mLTMB1瓶10mL矿物油1管1mL30 H2O21管75mL储存条件：试剂盒保存在18以下；试剂盒保存在28。有效期：6个月。2.1.3 自备试剂： 2.1.3.1 20×SSC（pH 7.0）NaCl 175.3g柠檬酸钠 88.2g 加蒸馏水 750mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至1000mL，并高

3、压灭菌保存。2.1.3.2 10% SDS（pH 7.0）SDS 20g加蒸馏水 180mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至200mL。2.1.3.3 1M柠檬酸钠（pH 5.0） 柠檬酸钠 294g加蒸馏水 700mL溶解，用浓HCl调pH至5.0，最后定容至1000mL。2.1.3.4 A液（2×SSC，0.1%SDS， pH 7.4）20×SSC 100mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.5 B液（0.5×SSC，0.1%SDS， pH 7.4）20×SSC 25mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至100

4、0mL2.1.3.6 C液（0.1M柠檬酸钠，pH 5.4）1M柠檬酸钠 100mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.7 显色液（新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液）C液 19 mLTMB 1 mL30% H2O2 2 L2.2 仪器某公司某型移液器某公司某型离心机某公司某型生物安全柜某公司某型PCR仪某公司某型水浴锅某公司某型分子杂交仪某公司某型水平摇床某公司某型扫描仪3 操作规程3.1 DNA提取3.1.1 在1.5mL离心管中加入800mL裂红液及100mL抗凝全血，充分混匀，室温放置23min，8000rpm离心2分钟，弃去上清，小心保留管底沉淀。3.1.2 加入10L变性液A和25

5、0L充分摇匀的变性液B，充分混匀，室温放置5分钟，8000rpm离心5秒钟，弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。3.1.3 向沉淀中加800L洗涤液I，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀（沉淀无色透明）。3.1.4 往管中加入800mL洗涤液，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8,000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。将离心管倒置在吸水纸上片刻，小心保留管底沉淀。3.1.5 往管中加入800mL无水乙醇，旋涡振荡器上充分悬浮沉淀，8,000rpm离心5秒钟，小心弃去上清。用吸头吸弃残液，小心保留管底沉淀。（

6、 注：多洗涤一次可有效提高DNA纯度）3.1.6 沉淀置于真空旋转干燥仪中60干燥约10min或金属浴干燥约35分钟，当沉淀完全干燥成白色粉末后加入100mL溶解液，旋涡震荡混匀，60保温10分钟，8,000rpm离心5秒钟(使用13000rpm离心5分钟可提高DNA纯度)，上清即可做为PCR模板。3.2 PCR扩增3.2.1 样品数为n，则取出n+1管PCR反应液，其中一管为阴性质控。3.2.2 5,000rpm离心2秒，在管壁上做好标记，而后分别加入已提取的待测样品DNA 2mL，反应总体系为25mL。阴性质控：以2mL纯水为模板，作空白对照。3.2.3 每管滴入一滴矿物油，按以下条件进行

7、扩增：50 15min95 10min94 1min 55 30s 循环35次72 30s72 5min 3.3 杂交 3.3.1 取15 mL 塑料离心管，放入标有编号的膜条（应在膜条的一角标记），加入A液56mL及所有（25L）PCR产物，将盖拧紧，再将离心管盖稍拧松，以避免加热时管盖爆开。3.3.2 将离心管放入沸水浴中加热10分钟（确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下）。3.3.3 取出拧紧盖子，放入杂交箱42杂交1.5小时以上，但不超过4小时。 3.3.4 往50mL塑料管加入40mL B液，放置于杂交箱或水浴箱中，预热至42。 3.4 洗膜 取出膜条，移至装有预热B液的50 mL管

8、中，于42轻摇洗涤15分钟（每管40mL 溶液，最多可同时洗涤4张膜）。 3.5 显色 3.5.1 酶标液的配制：POD:A液以1: 2000的比例配制POD溶液（1张膜条1微升POD）3.5.2 将洗膜完毕的膜条放入新配制的酶标液中，室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。3.5.3 用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。3.5.4 用C液室温洗膜1-2分钟，同时配制显色液（显色液需新鲜配制，配法见2.1.3.7）。将膜条浸泡于显色液中避光显色5分钟至20分钟左右即可观察结果。 3.6 膜条扫描及保存 倒去显色液，用清水冲洗一次膜条，对检测结果进行扫描、保存。 4 结果判读4.1 结果读取膜条上的

9、突变位点有信号，说明待检样品含有该类型突变；若该突变位点对应的正常对照也有信号，说明待检样品为该类型突变的杂合子；若该突变位点对应的正常对照没有信号，说明待检样品为该类型突变纯合子。检测的位点突变与正常对照关系说明：位点名称检测的突变类型突变点简称正常对照点位点名称检测的突变类型突变点的简称正常对照位点CD41-42-TTCT41-42M41-42NCD17AT17M17NCD43GT43MCD31-C31M31NIVS-654CT654M654NCD14-15+G14-15M无-28AG-28M-28NCD27-28+C27/28M-29AG-29MIVS-1GA,GTIVS-1M-30TC

10、-30MIVS-5GCIVS-5M-32CA-32MCAP+1ACCAPCD71-72+A71-72M71-72NInitiation codonATGAGGIntMEGAGAAGEMEN4.2 质量控制4.3.1 阴性对照膜条上若有杂交斑点，提示为实验有污染，实验结果无效。4.3.2 样品膜条上没有一个斑点，该样品实验无效。5 检测特性本方法的检出限为2ng/L的人基因组DNA。6 检测方法的局限性该试剂盒能检测中国人常见的17种-珠蛋白基因突变，检测覆盖率达98%以上，但仍有罕见的突变类型在本试剂盒检测范围之外，可能造成漏检，这类样本需用其它方法进一步验证。7 临床意义用于-地中海贫血临床

11、患者、婚前、产前筛查样本的检测，能够定性检出中国人常见的17种-珠蛋白基因突变。8 注意事项8.1 在运输过程中会有PCR反应液附着在管壁/盖上，因此请在使用前先离心，以保证PCR反应体系的体积及防止潜在的污染。8.2 14-15M、CAP、IntM、IVS-1M、IVS-5M为少见类型，本系统未设置正常对照，检测结果仅报告点突变，建议做进一步分析。8.3 PCR反应液在使用前应避免反复冻融。8.4 杂交全过程要避免用手接触膜条，可应用镊子夹取膜条边角操作，或戴手套操作。样品处理所使用的离心管及实验过程使用的吸头应高压灭菌并一次性使用。 8.5 室温低于20 时，A、B液中可能会有结晶析出，使用前应先温浴使之溶解。8.6 杂交、洗膜温度应严格控制在42±0.5。8.7 膜条较多时，洗液体积不能过小。8.8 显色液需现配现用，配制时应按顺序加入C液、TMB和H2O2显色过程应避光，可放入暗盒中操作。 8.9 TMB有毒，请戴手套操作。8.10 H2O2存放时间不能过长，若存放时间过长应适当增加用量或者更换新的H2O2。8.11 显色过程应避光，可放入暗