样本DNA纯化、保存方法ppt课件

1、样本样本DNA提取、纯化、保管方法提取、纯化、保管方法一一. DNA种类：种类：w真核生物真核生物DNA、细菌、细菌DNA、病、病毒毒DNA、质粒、质粒DNAw细胞悬液细胞悬液DNA、组织、组织DNAw双链环状、双链线性、单链环状双链环状、双链线性、单链环状w细胞核细胞核DNA、细胞器、细胞器DNA二二. 提取提取DNA总的原那么：总的原那么：w1. 保证核酸一级构造的完好保证核酸一级构造的完好性；性；w2. 核酸样品中不应存在对酶核酸样品中不应存在对酶有抑制造用的有机溶剂和过有抑制造用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；高浓度的金属离子；w其他生物大分子如蛋白质、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂

2、类分子的污染应降多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；低到最低程度；w4. 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。也应尽量去除。三三. DNA样品预备样品预备 1. 生物组织：w最好新颖组织，假设不能马最好新颖组织，假设不能马上提取，应储存上提取，应储存70或液或液氮氮w液氮冷冻敲碎研磨液氮冷冻敲碎研磨w组织匀浆法组织匀浆法w液氮匀浆法液氮匀浆法2. 培育细胞培育细胞w悬浮生长细胞：悬浮生长细胞：1500g离心，离心，410分钟搜集细胞分钟搜集细胞w单层培育细胞：可用刮棒或胰单层培育细胞：可用刮棒或胰酶消化后离心搜集酶消化后离心搜集 3、血液样品、血液样品血液抗凝易用柠檬酸抗凝

3、血液抗凝易用柠檬酸抗凝液液ACD： 柠檬酸柠檬酸 0.48g 柠檬酸钠柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄右旋葡萄糖糖 1.47g 加加H2O 至至 100ml 每每6ml新颖血液加新颖血液加1ml ACD液，液，0保管数天，保管数天，-70长期储存。长期储存。 四四. DNA提取提取 1. 酚抽提法：w先用蛋白酶先用蛋白酶K、SDS破碎细胞，破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚消化蛋白，然后用酚和酚-氯氯仿抽提，最后乙醇沉淀。获仿抽提，最后乙醇沉淀。获DNA大小为大小为100150kb 2. 甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法：w破碎细胞同上，然后用高浓破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与度甲酰胺解聚

4、蛋白质与DNA的结合，再透析获得的结合，再透析获得DNA。可得可得DNA 200kb左右。左右。 3. 玻璃棒缠绕法：w用盐酸胍裂解细胞，将裂解用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩物铺于乙醇上，然后用带钩或或U型玻璃棒在界面轻搅，型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成沉淀液绕于玻棒。生成DNA约约80kb。 4. 异丙醇沉淀法：w根本同根本同1法，仅用二倍容积异法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小分丙醇替代乙醇，可去除小分子子RNA在异丙醇中可溶形在异丙醇中可溶形状。状。 5. 外表活性剂快速制备法： 用Triton X-100或NP40外表活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶

5、K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。 6. 加热法快速制备：w加热法快速制备：加热加热法快速制备：加热96100，5分钟，然后离心分钟，然后离心后取上清，可用于后取上清，可用于PCR反响。反响。 7. 碱变性快速制备：w先用先用NaOH作用作用20分钟，再分钟，再加加HCl中和，离心后取上清，中和，离心后取上清，含少量含少量DNA。 五、五、DNA的浓缩的浓缩1.固体聚乙二醇固体聚乙二醇PEG浓缩：浓缩：w用透析袋外敷用透析袋外敷PEG至适宜量。至适宜量。w2. 丁醇抽提浓缩：丁醇抽提浓缩：wDNA溶液中水可分配到正丁溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但醇或仲丁醇，但DNA不会。不会。因此反复几次可

6、显著减少因此反复几次可显著减少DNA体积。体积。 3. 乙醇或异丙醇沉淀：w1需求阳离子盐的存在需求阳离子盐的存在w w NaAc最常用，最常用，w NaCl对含对含SDS样品好，样品好，w NH4Ac去除去除dNTP好，好，w LiCl沉淀沉淀RNA好，但不能好，但不能用于反转录前。用于反转录前。w2沉淀温度与时间沉淀温度与时间 w 0，1015分钟。分钟。w3离心离心 w 04，12000g，10分钟，分钟，小于小于100bp DNA需超速离心需超速离心w4、精胺沉淀法、精胺沉淀法 w与与DNA结合后使结合后使DNA构造凝构造凝缩沉淀，需在无盐或低盐溶缩沉淀，需在无盐或低盐溶液。液。六六.

7、 DNA的鉴定的鉴定1. 分光光度法分光光度法w在在260nm和和280nm处测定处测定DNA溶溶液的光吸收，液的光吸收，A260与与A280之比之比应在应在1.751.80。低于此值阐明。低于此值阐明制备物中留有蛋白质成份或酚。制备物中留有蛋白质成份或酚。高于此值阐明有高于此值阐明有RNA的残留量。的残留量。 2. 凝胶电泳分析凝胶电泳分析(1). 影响琼脂糖凝胶DNA 迁移率的要素 A、DNA的分子大小 分子越大迁移速度越慢wB、琼脂糖浓度、琼脂糖浓度 迁移率与浓迁移率与浓度成反比度成反比w琼脂糖含量琼脂糖含量W/V 线性线性DNA分别范围分别范围Kbw0.3 5 - 60w0.6 1 -

8、 20w0.7 0.8 - 10w0.9 0.5 - 7w1.2 0.4 - 6w1.5 0.2 - 3w 2.0 0.1 2wC、DNA构象构象 w一样分子量的超螺旋环状一样分子量的超螺旋环状型，切口环状型，切口环状型型和线状和线状型型DNA，以不，以不同速率经过凝胶，同速率经过凝胶，w普通情况下，迁移率普通情况下，迁移率型型型型型型wD、电压、电压 w迁移率与所加电压成正比，迁移率与所加电压成正比，但过大有效分别范围变小。但过大有效分别范围变小。2Kb DNA, 电压电压5V/cm。wE E、电场方向、电场方向 w 单一方向速率均等，改动单一方向速率均等，改动方向，极大分子方向，极大分子D

9、NADNA迁移更迁移更慢。经过脉冲电场凝胶电泳慢。经过脉冲电场凝胶电泳分别极大分别极大DNADNA。2 2. DNA. DNA的检测的检测A A、用溴乙锭染色、用溴乙锭染色w在在254nm254nm紫外光下检测，如紫外光下检测，如需回收最好在需回收最好在300nm300nm紫外光紫外光下割胶，否那么易脱嘌呤而下割胶，否那么易脱嘌呤而断链，在断链，在1cm1cm宽带上可检到宽带上可检到10ng DNA10ng DNA。B B、用银染法、用银染法wAg+Ag+与与DNADNA构成复合物，在甲构成复合物，在甲醛复原下可染成黑褐色，灵醛复原下可染成黑褐色，灵敏度高敏度高200200倍，但不能回收。倍，

10、但不能回收。3 3. . 分分 析析w通常与知分子量的规范通常与知分子量的规范DNADNA片片段一同电泳，经比较可获知段一同电泳，经比较可获知DNADNA标本大小。如条带拖尾，标本大小。如条带拖尾，系参与系参与DNADNA量太多或凝胶未制量太多或凝胶未制好。如分子量小或一片糊状，好。如分子量小或一片糊状，表示表示DNADNA有降解。有降解。w为了判别目的为了判别目的DNA片段的大小，片段的大小，常在同一凝胶的目的常在同一凝胶的目的DNA旁加一分子旁加一分子量参照物，同时电泳并染色后，就能量参照物，同时电泳并染色后，就能在紫外灯下很快知道目的片段的大小。在紫外灯下很快知道目的片段的大小。最常用的

11、分子量参照物是最常用的分子量参照物是 Hind 消消化物，各片段的大小以化物，各片段的大小以bp表示，分别表示，分别为：为：23130，9416，6557，4361，2322，2027，564，125。4 4. DNA. DNA回收回收wA A、电泳到、电泳到DEAE-DEAE-纤维素膜纤维素膜 w 在所需条带前插入在所需条带前插入DEAT-DEAT-纤纤维素膜，继续电泳至条带维素膜，继续电泳至条带DNADNA都到膜上，取出洗下。都到膜上，取出洗下。wB B、透析袋电洗脱、透析袋电洗脱 w 切下条带的琼脂糖凝胶，切下条带的琼脂糖凝胶，放放 透析袋内，加缓冲液后透析袋内，加缓冲液后继续电泳，继续

12、电泳，DNADNA出胶后回收。出胶后回收。wC C、低熔点琼脂糖凝胶、低熔点琼脂糖凝胶 w 切下胶，加热到切下胶，加热到6565熔化胶，熔化胶，然后用酚抽提回收然后用酚抽提回收DNADNA。七七. DNA. DNA的定量的定量1. 1. 分光光度法：分光光度法：测定测定DNADNA在在A260nmA260nm的光吸的光吸收，计算浓度收，计算浓度A260A260稀释倍数稀释倍数5050 g/ml (g/ml (双链双链DNA)DNA)A260A260稀释倍数稀释倍数4040 g/ml (g/ml (单链单链DNA)DNA)A260A260稀释倍数稀释倍数2020 g/ml (g/ml (单链寡核苷酸单链寡核苷酸DNA)DNA)2.琼脂糖平板法：琼脂糖平板法：w在含溴乙锭琼脂糖平板上滴在含溴乙锭琼脂糖平板上滴1 15l5l样品样品DNADNA和知浓度规和知浓度规范品，放置数小时后比较检范品，放置数小时后比较检测。测。3. 3. 微型凝胶电泳：微型凝胶电泳：w将样品和规范品同时