第六章分子生物学研究法

1、2021-11-251第六章第六章 分子生物学研究法（下）分子生物学研究法（下）基因功能基因功能研研究技究技术术2021-11-2512021-11-252第六章第六章 分子生物学研究法（下）分子生物学研究法（下）2021-11-252从从20世世纪纪中叶中叶开开始，分子生物始，分子生物学研学研究得究得到高速到高速发发展，主要原因之一是展，主要原因之一是研研究方法，特究方法，特别别是基因是基因操作和基因工程技操作和基因工程技术术的的进进步。步。基因操作主要包括基因操作主要包括DNA分子的切割分子的切割与连与连接、核酸分子接、核酸分子杂杂交、凝交、凝胶电胶电泳、泳、细细胞胞转转化、核酸序列化、核

2、酸序列分析以及基因人工合成、定点突分析以及基因人工合成、定点突变变和和PCR扩扩增等，是增等，是分子生物分子生物学研学研究的核心技究的核心技术术。2021-11-253第六章第六章 分子生物学研究法（下）分子生物学研究法（下）内内容：容：1. 基因表达研究技术2. 基因敲除技术3. 蛋白质及RNA相互作用技术4. 基因芯片及数据分析5. 其他分子生物学技术2021-11-2532021-11-254第一节第一节 基因表达研究技术基因表达研究技术1. 基因表基因表达达系列分析技系列分析技术术（SAGE）SAGE是以是以DNA序列序列测测定定为为基基础础分析全基因分析全基因组组表表达达 模式的技模

3、式的技术术。任何。任何长长度超度超过过9-10个碱个碱基的核基的核 苷苷酸片段都可能代表一酸片段都可能代表一种种特特异异性的性的转录产转录产 物，因此，根据某物，因此，根据某个个序列占序列占总标签数总标签数的比例的比例 可分析所可分析所对应对应基因的表基因的表达频达频率。率。 LongSAGE技技术术。标签来标签来自自转录转录物物3端一段端一段21bp的序列，可的序列，可 以以进进行快速分析行快速分析并与并与基因基因组组序列序列数数据相匹据相匹 配。其原理配。其原理与与ShortSAGE方法方法类类似，只是似，只是 用了不同的用了不同的IIS类标签类标签酶酶（MmeI），），并将并将程程 序做

4、了相序做了相应应修改。修改。2021-11-2542021-11-255常规常规SAGE方法方法 （short SAGE）基本基本 流程流程2021-11-256第一节第一节 基因表达研究技术基因表达研究技术2 RNA的的选择选择性剪接技性剪接技术术RNA的的选择选择性剪接是指用不同的剪接方式性剪接是指用不同的剪接方式从从 一一个个mRNA前体前体产产生不同的生不同的mRNA剪接剪接异构异构 体的体的过过程。可分程。可分为为：平衡剪切、：平衡剪切、5选择选择性剪性剪 切、切、3选择选择性剪切、外性剪切、外显显子子遗遗漏型剪切及相漏型剪切及相 互排互排斥性剪切。常用斥性剪切。常用RT-PCR法法

5、研研究某究某个个基基 因是否存在因是否存在选择选择性剪性剪切。切。2021-11-256 果蝇果蝇Dscam基因可基因可 以通过可以通过可变 剪 接 产 生变 剪 接 产 生38000多种可能多种可能的的mRNA异构体异构体2021-11-257选择性剪切的不同类型选择性剪切的不同类型 RT-PCR检测检测5个拟南芥转录个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切调控因子基因的选择性剪切2021-11-258第一节第一节 基因表达研究技术基因表达研究技术3. 原位原位杂杂交技交技术术原位原位杂杂交（交（ISH）是）是 用用标记标记的核酸探的核酸探针针，经经放射自放射自显显影或非影或非放射放射 检测检测

6、体系，在体系，在组织组织、细细胞、胞、间间期核及染色体期核及染色体 上上对对核酸核酸进进行定位和相行定位和相对对定量定量研研究的一究的一种种手手 段，分段，分为为RNA和染色体原位和染色体原位杂杂交交两两大大类类。RNA原位原位杂杂交用放射性或非放射性（如地高交用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素等）辛、生物素等）标记标记的特的特异异性探性探针与针与被固定被固定 的的组织组织切片反切片反应应，若，若细细胞中存在胞中存在与与探探针针互互补补 的的mRNA分子，分子，两两者者杂杂交交产产生生双链双链RNA，可，可 通通过过放射性放射性标记标记或或经经酶促免疫酶促免疫显显色，色，对该对该基基 因的

7、表因的表达产达产物做出物做出定性定量分析。定性定量分析。2021-11-2582021-11-259mRNA的互补链，的互补链， 杂 交 信 号 集 中 于杂 交 信 号 集 中 于 纤维细胞中。纤维细胞中。负对照，负对照，mRNA的的 同义同义链链, 无杂交无杂交 信号信号正对照，正对照，UBQ10杂交信杂交信号遍布于号遍布于 整个整个胚珠胚珠2021-11-2510第一节第一节 基因表达研究技术基因表达研究技术3. 原位原位杂杂交技交技术术荧荧光原位光原位杂杂交（交（FISH）首先首先对对寡核寡核苷苷酸探酸探针针做特殊的修做特殊的修饰饰和和标记标记， 然后用原位然后用原位杂杂交交法法与靶与

8、靶染色体或染色体或DNA上特定上特定 的序列的序列结结合，再通合，再通过与荧过与荧光素分光素分子相耦子相耦联联的的 单单克隆抗体克隆抗体来来确定确定该该DNA序列在染色体上的序列在染色体上的 位位置。置。2021-11-25102021-11-2511第一节第一节 基因表达研究技术基因表达研究技术4. 基因定点突基因定点突变变技技术术通通过过改改变变基因特定位点核基因特定位点核苷苷酸序列酸序列来来改改变变所所 编码编码的的氨氨基酸序基酸序列，用于列，用于研研究某究某个个（些）（些）氨氨 基酸基酸残残基基对对蛋白蛋白质质的的结构结构、催化、催化活性以及活性以及结结 合配体能力的影合配体能力的影响

9、响，也可用于改造，也可用于改造DNA调调控控 元元件特征序列、修件特征序列、修饰饰表表达载达载体、引入新的酶切位点等。体、引入新的酶切位点等。目前，主要采用目前，主要采用两种两种PCR方法，重方法，重叠叠延伸技延伸技 术术和大引物和大引物诱变诱变法，在基因序列中法，在基因序列中进进行定点行定点 突突变变。2021-11-25112021-11-2512 寡核苷酸寡核苷酸介导的介导的 DNA突变技突变技 术术2021-11-2513重叠延伸介导的定点诱变重叠延伸介导的定点诱变大引物诱变法大引物诱变法2021-11-2514第二节第二节 基因敲除技术基因敲除技术1. 基本原理基本原理经经典典遗传学

10、遗传学（Forward genetics）是）是从从一一 个个突突变变体的表型出体的表型出发发，研研究其基因型，究其基因型，进进而而 找出找出该该基因的基因的编码编码序列。序列。现现代代遗传学遗传学（Reverse genetics，反向，反向遗传遗传 学学）首先）首先从从基因基因序列出序列出发发，推，推测测其表其表现现基因敲除（基因敲除（gene knock-out）又）又称称基因打基因打 靶靶，通，通过过外源外源DNA与与染色体染色体DNA之之间间的同源重的同源重 组组，进进行精确的定点修行精确的定点修饰饰和和基因改造，具有基因改造，具有 专专一性强、染色体一性强、染色体DNA可可与与目的

11、片段共同目的片段共同稳稳 定定遗传遗传等特点。型，等特点。型， 进进而推而推导导出出该该基因的功能。基因的功能。2021-11-25141. 基本原理基本原理v 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。全基因敲除）两种。n完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性n条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时 间和空间的基因敲除。v 噬菌体的噬菌体的Cre/Loxp系统、系统、Gin/Gix系统、酵母系统、酵母 细胞的细胞的FLP/FRT系统和系统和R/RS系统是现阶段常系统是现阶段常 用的

12、四种定位重组用的四种定位重组系统，尤以系统，尤以Cre/Loxp系统系统 应用最为广泛。应用最为广泛。2021-11-25152021-11-25152021-11-2516用取代型（用取代型（a）或插入型（）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验）载体进行完全基因敲除实验2021-11-2517正负筛选法（正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞法）筛选已发生同源重组的细胞第二节第二节 基因敲除技术基因敲除技术2. 高等高等动动物基因敲除技物基因敲除技术术真真核生物基因敲除的技核生物基因敲除的技术术路路线线主要包括主要包括构构建建 重重组组基因基因载载体，体，用用电电穿孔、穿孔、显显微

13、注射等方法微注射等方法 把重把重组组DNA导导入胚胎干入胚胎干细细胞胞纯纯系中，使外系中，使外 源源DNA与与胚胎干胚胎干细细胞基因胞基因组组中相中相应应部分部分发发 生同生同源重源重组组，将将重重组载组载体中的体中的DNA序列整序列整 合到合到内内源基因源基因组组中中并并得以表得以表达达。显显微注射命中率微注射命中率较较高，技高，技术难术难度相度相对对大些。大些。 电电穿孔法命中穿孔法命中率比率比显显微注射低，操作使用方微注射低，操作使用方 便。便。胚胎干胚胎干细细胞（胞（ES细细胞）分离和体外培胞）分离和体外培养养的的 成功奠定了哺乳成功奠定了哺乳动动物基因敲除的技物基因敲除的技术术基基础

14、础。2021-11-25182021-11-25182021-11-2519 模式动物小鼠模式动物小鼠中完全基因敲除的中完全基因敲除的主要技术主要技术 策略与策略与应用。应用。第二节第二节 基因敲除技术基因敲除技术3. 植物基因敲除技植物基因敲除技术术T-DNA插插入失活技入失活技术术是目前在植物中使用最是目前在植物中使用最 为为广泛的基因广泛的基因敲除手段。敲除手段。利用根癌利用根癌农农杆菌杆菌T-DNA介介导转导转化，化，将带将带有有报报 告基因的告基因的DNA序列整合到基因序列整合到基因组组DNA上，如上，如 果果这这段段DNA插插入到目的基因入到目的基因内内部或附近，就部或附近，就 会

15、会影影响该响该基因的表基因的表达达，从从而使而使该该基因基因“ “失失 活活” ”。2021-11-25202021-11-25202021-11-2521植物基因敲除及突变体筛选植物基因敲除及突变体筛选 a.引物设计。引物设计。LP和和RP分别代表插入基因两端的引分别代表插入基因两端的引物，物，LB是指载体上的一段是指载体上的一段 引物，目的基因片段引物，目的基因片段(设为设为900bp)。旁邻序列是经测。旁邻序列是经测序后获得的序后获得的DNA序列。序列。 b. PCR产物电泳结果。产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和分别代表野生型、杂合子和纯合子纯合子PCR条带。条带。第三节第三节 蛋

16、白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术1. 酵母酵母单杂单杂交系交系统统酵母酵母单杂单杂交系交系统统是上世是上世纪纪90年代中年代中发发展起展起来来的的研研究究DNA-蛋蛋白白质质之之间间相互作用的新技相互作用的新技术术，可，可识别稳识别稳定定结结合于合于DNA上的蛋上的蛋白白质质，在酵母，在酵母细细胞胞内研内研究究真真核生物中核生物中DNA-蛋白蛋白质质之之间间的相的相互作用，互作用，并并通通过筛选过筛选DNA文文库库直接直接获获得得靶靶序列相互作用序列相互作用 蛋蛋白的白的编码编码基因。基因。将将已知已知顺顺式作用元件式作用元件构构建到最基本建到最基本启动启动子（子（Pmin）的上游

17、，）的上游，把把报报告基因告基因连连接到接到Pmin下游。下游。将编码将编码待待测转录测转录因子因子cDNA与与已知酵母已知酵母转录转录激活激活结构结构域（域（AD）融合表）融合表达载达载体体导导入酵母入酵母细细胞，胞，该该基因基因产产物如果能物如果能够与顺够与顺式作用元件相式作用元件相结结合，就能激活合，就能激活 Pmin启动启动子，使子，使报报告基因得到表告基因得到表达达。2021-11-25222021-11-25222021-11-2523从拟南芥从拟南芥cDNA文库中文库中 筛选与顺式元筛选与顺式元 件件DRE结结合的合的 转录因子示意图。转录因子示意图。 酵母单杂交的基本酵母单杂交

18、的基本原理示意图原理示意图第三节第三节 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术2. 酵母酵母双杂双杂交系交系统统真真核生物核生物转录调转录调控因子具有控因子具有组组件式件式结构结构 （modular）特征，）特征，这这些蛋白往往由些蛋白往往由两个两个或或两个两个以以 上相互上相互独独立的立的结构结构域，其中域，其中DNA结结合合结构结构域域 （binding domain，BD）和）和转录转录激活激活结结构构域域 （activation domain，AD）是）是转录转录激活因子激活因子发挥发挥 功功能所必能所必须须的。的。BD能能与与特定基因特定基因启动区结启动区结合，但不能激活基因

19、合，但不能激活基因转转 录录，由不，由不同同转录调转录调控因子的控因子的BD和和AD所形成的所形成的杂杂合合 蛋白却能行使激活蛋白却能行使激活转录转录的功能。的功能。2021-11-25242021-11-25242021-11-2525 酵母双杂交的基本原理示意图酵母双杂交的基本原理示意图第三节第三节 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术3. 体外蛋白体外蛋白质质相互作相互作用技用技术术Far Western印迹技印迹技术术用用32P标记标记的体外表的体外表达达蛋蛋白作探白作探针针,直接直接检测检测 与该与该蛋白蛋白发发生相互作用的蛋白生相互作用的蛋白或表或表达该达该蛋白蛋白 的的

20、cDNA。2021-11-25262021-11-2526第三节第三节 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术3. 体外蛋白体外蛋白质质相互作用相互作用技技术术GST融合蛋白沉降技融合蛋白沉降技术术利用利用GST对对谷胱甘谷胱甘肽肽偶偶联联的的琼琼脂糖球珠的脂糖球珠的亲亲 和性，和性，从从混混合蛋白合蛋白质样质样品中品中纯纯化得到相化得到相互作互作 用蛋白。用蛋白。2021-11-25272021-11-2527第三节第三节 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术3. 体外蛋白体外蛋白质质相互作用相互作用技技术术蛋白蛋白质质芯片技芯片技术术蛋白蛋白质质芯片可以用芯片可以用来来大

21、大规规模模筛选筛选蛋白之蛋白之间间的的 相互作用。相互作用。将荧将荧光光标记标记的探的探针针蛋白蛋白与与蛋蛋白白质质 芯片孵育，洗芯片孵育，洗脱脱非特非特异异性性结结合的蛋白后，可合的蛋白后，可 以通以通过过扫扫描芯片上的描芯片上的荧荧光点光点检测检测到到稳稳定的相定的相 互作用蛋白点。互作用蛋白点。2021-11-25282021-11-2528第三节第三节 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术3. 体外蛋白体外蛋白质质相互作用技相互作用技术术等离子表面共振技等离子表面共振技术术将诱饵将诱饵蛋白蛋白结结合于葡聚糖表面合于葡聚糖表面并并固定于固定于纳纳米米 级级厚度的金厚度的金属属膜

22、膜上。上。当当蛋白蛋白质质混合物混合物经过经过 时时，如果有蛋白，如果有蛋白质质同同“ “诱饵诱饵” ”蛋白蛋白发发生相互作用，那生相互作用，那么两么两者的者的结结合合将将使金使金属属膜表面的折膜表面的折 射率上升，射率上升，导导致共振角度的改致共振角度的改变变。2021-11-25292021-11-2529第三节第三节 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术3. 体外蛋白体外蛋白质质相互作用技相互作用技术术免疫共沉淀技免疫共沉淀技术术将靶将靶蛋白的抗体蛋白的抗体连连接到固体基接到固体基质质上，再上，再将将可可 能能与靶与靶蛋白蛋白发发生生相互作用的待相互作用的待筛选筛选蛋白加入蛋白

23、加入 反反应应体系中，用低离心力沉淀或体系中，用低离心力沉淀或微膜微膜过滤过滤法法 在固体基在固体基质质和抗体和抗体的共同作用下的共同作用下将将蛋白蛋白复复合合 物沉物沉淀到淀到试试管的底部或微膜上。管的底部或微膜上。2021-11-25302021-11-2530第三节第三节 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术4. 细细胞胞内内蛋白蛋白质质相互作用相互作用研研究究荧荧光共振能量光共振能量转转移法（移法（FRET）FRET荧荧光能量光能量转转移有三移有三个个基本基本条条件：件：给体与受体在合适的距离（110 nm）；给体的发射光谱与受体的吸收光谱有 一定的重叠（这是能量匹配的条件）

24、；给体与受体的偶极具有一定的空间取 向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。2021-11-25312021-11-2531第三节第三节 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术5. RNAi（RNA干涉）技干涉）技术术及其及其应应用用RNAi技技术术利用利用双链双链小小RNA高效、特高效、特异异性降解性降解 细细胞胞内内同源同源mRNA从从而阻而阻断靶断靶基因表基因表达达，使，使细细胞出胞出现靶现靶基因缺失的表型。基因缺失的表型。RNAi的命名的命名来来源于安德源于安德鲁鲁法尔法尔1998年在年在自然自然杂杂志上的志上的 论论文。文。研研究究发现发现，双链双链RNA是是RNAi的的触发触发

25、物，引物，引 发与发与之互之互补补的的单单链链RNA（ssRNA, single- stranded RNA）的降解。）的降解。经过经过Dicer（一（一种种具有具有RNAase III活性的核酸活性的核酸 酶）的加工，酶）的加工，细细胞中胞中较长较长的的双链双链RNA（30个个核核苷苷酸以上）首先被降解形酸以上）首先被降解形成成2125个个核核苷苷 酸的小分子干酸的小分子干扰扰核糖核酸（核糖核酸（siRNA，short interfering RNA ），），并并有效定位目有效定位目标标 mRNA。2021-11-25322021-11-25322021-11-2533 RNAi作用机作用机

26、 制制示意图。示意图。第三节第三节 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术5. RNAi（RNA干干 涉）技涉）技术术及其及其应应用用siRNA是引是引发转录发转录后基因沉默中序列特后基因沉默中序列特异异性性 RNA降解的重降解的重要中要中间间媒介，媒介，它它具有特殊的具有特殊的结结 构构特征，即特征，即5端磷酸基端磷酸基团团和和3端的端的羟羟基，其基，其 两条链两条链的的3端各有端各有两个碱两个碱基突出于末端。基突出于末端。由由siRNA中的反中的反义链参与义链参与指指导导合成被合成被称为称为 RNA诱导诱导的沉默的沉默复复合体（合体（RISC）的核蛋白）的核蛋白 体，再由体，再由R

27、ISC介介导导切割目的切割目的mRNA分子中分子中与与 siRNA反反义链义链互互补补的的区区域，域，从从而而实现实现干干扰扰靶靶 基因表基因表达达的功能。的功能。2021-11-25342021-11-2534第四节第四节 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析基因芯片及基因芯片及数数据分析据分析基因芯片（基因芯片（DNA chip），又），又称称DNA微微阵阵列列 （DNA microarray）技）技术术是能同是能同时监测时监测大量大量靶靶 基因表基因表达达的的实验实验手手段，段，从从而迅速准确地在基因而迅速准确地在基因组组水平上水平上阐阐述不同生物述不同生物组织组织或或细细胞中各胞中各种

28、转录种转录 本的本的变变化化规规律。律。2021-11-25352021-11-25352021-11-2536v基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析v 简易基因芯片简易基因芯片v 使用机械臂把使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜片段点在玻璃片或尼龙膜 上，经过物上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以理吸附作用达到固定化。也可以 直接在玻璃板表面进行直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到化学合成，从而得到 寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的的cDNA 或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处 理理，便可以观察到大规模的基因群在

29、不同组，便可以观察到大规模的基因群在不同组 织或同一组织织或同一组织不同发育时期或不同生理条件不同发育时期或不同生理条件 下的表达模式。下的表达模式。v 基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人基因芯片可用于进行基因诊断。先建立正常人 特定组织特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信、器官的基因芯片，给出标准杂交信 号图，用可疑病人号图，用可疑病人的的cDNA做探针与之杂交，确做探针与之杂交，确 定哪些基因的表达受抑制或定哪些基因的表达受抑制或激活。激活。2021-11-2536第五节第五节 其他分子生物学技术其他分子生物学技术1. 凝凝胶滞缓实验胶滞缓实验凝凝胶滞缓试验胶滞缓试验（gel r

30、etardation assay），）， 又叫作又叫作DNA迁迁移率移率变动试验变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外），是用于体外研研究究DNA与与蛋白蛋白质质 相互作用的一相互作用的一种种特殊的凝特殊的凝胶电胶电泳技泳技术术。在凝在凝胶电胶电泳中，由于泳中，由于电场电场的作用，裸露的的作用，裸露的DNA 朝正朝正电极电极移移动动的距离的距离与与其分子量的其分子量的对数对数成反成反 比。如果此比。如果此时时DNA分子分子与与某某种种蛋白蛋白质质相相结结合，合， 那那么么，由于分子量增大，由于分子量增大，它它在凝在凝胶胶中中的的迁迁移作移作 用便用便会会受到阻受到阻滞滞，在特定，在特定电压电压和和时间内时间内朝正朝正电电 极极移移动动的距离也就相的距离也就相应缩应缩短了。短了。2021-11-25372021-11-2537第五节第五节 其他分子生物学技术其他分子生物学技术拟拟南芥南芥转录转录 因子因子与与不同不同 DNA元件有元件有不同的不同的结结合合能力。能力。2021-11-25382021-11-2538第五