免疫实验-ICC用细胞抗原的制备

1、icc用细胞抗原的制备_、材料和试剂1.0.01m pbs(ph7.4) : naci 8.0g ; kci 0.2g ; na2hpo4 1.44g ; kh2po4 0.24g ; ddh20 至1000ml ;高压灭菌,分装。2、0.25%胰:称取 edta 0.02g naci 0.8g kci 0.04g 加三蒸水 100ml 溶解后加 0.25g 胰酶，轻轻搅动，使胰酶溶解，不要产生泡沬，加酚红少许，调ph值到8.2-8.6m滤除菌，分装10ml/ 管厂20°c保存临用前预温到37°co3、 诱导液仃pa) :12邻十四酰佛波醇-13-乙酸酯(12-o-tetr

2、adecanoyl-phorbol-13-acetate,tpa)溶于丙酮,配成 20mg/mlo二实验步骤（一）、用96孔级胞培养板制备贴壁细胞抗原（正常贴壁细胞）1、hff,nih3t3细胞用含10%血清dmem完全培养液在75cm2培养瓶中单层培养，使密度达 到90%2、倾去培养液,用无菌pbs液5-10ml洗细胞一次，用无菌吸管吸干pbs液。3、加0.25%胰酶（从20°c取出在37工预温）75平方厘米培养瓶加lml,37°c温箱或有经验者可在酒精灯周围，控制温度约37弋左右，轻轻摇匀使胰酶充分覆盖细胞表面。4、观察到细胞有松动，成流沙状下落;或在显微镜下观察，细胞

3、已有收缩变圆时,用无菌pbs液1520ml,终止反应。5、轻轻吹打下细胞，使细胞单个分散，并充分混匀1500转/分离心5-10分钟，去掉上清液6、打散细胞，加10ml含血清dmem完全培养液混匀，取10ul在显微镜下计数，计算细胞浓度。7、用含10%血清培养液调整细胞浓度至1x104个/looul,每孔（96孔）接种200ul（即2x104个细胞/孔）,37°c co2培养箱培养。&次日显微镜下观察細胞是否完全贴壁（一般24小时可完全贴壁准9去培养0.01m pbs液先二 次（孔中加满pbs,轻轻倒掉）并在滤纸上扣干仮复3次）应注意加液的力度，不能太大，以免冲掉细 胞，倒去上

4、清液在滤纸上扣干水份，但保持细胞湿润。9、加90%冷丙酮固定，每孔200ul,510min摔去冷丙酮，用pbs洗三次扣干。10、在培养板上作好标记（细胞名称,制备时间）。11、保鲜膜封好,70°c保存。（二）、悬浮细胞玻片法的抗原制备1、25平方厘米玻璃瓶用含10%血清的1640完全培养液培养bcbl-1细胞，密度达到80-90%2、加样枪充分吹匀细胞，收集于离心管中。3、1500转/分离心510分钟,弃去上清液。4、打匀细胞，用pbs洗二次，弃去上清。5、打匀细胞,加少量pbs液（根据肉眼观察细胞溶液的浊度估计）混匀，取少量在显微镜下计数，调 整浓度，估算在玻片上每个细胞涂片圈位（

5、12圈）接种细胞1x104个。6、室温下干燥,然后加100%的冷丙酮室温固定3-5分钝pbst洗二遍。7、室温干燥作好标记然后放入玻片盒，玻片盒用塑料袋密封并放一袋防潮剂厂20°c保存，一个月 内有效。（三）病毒感染细胞抗原的制备1、96孔培养的贴壁细胞的病毒感染及病毒抗原的制备1）未感染细胞接种到96孔板（方法见"悬浮细胞玻片法抗原制备"步）,并完全贴壁。2）摔去pbs液，加入少量病毒液（加入量由先做棋盘试验来确定浓度，或先测定病毒滴度而定，且 病毒液用2%-5%血清dmem完全培养液稀释），每孔50ul,摇匀,使充分覆盖细胞表面z37°cc02培养箱

6、培养（mcmv感染nih3t3 hcmv感染hff 13）每天观察细胞形态变化，早期cpe为细胞肿胀，中期聚集,晚期则圆缩。4）当圆缩细胞达到10%-30%左右細胞层出现明显的病灶同时还有正常细胞未感染即可收获 （一般情况下齐4天）。5）倒去上清（倒入有消毒液容器以防止污染环境）,用无菌pbs液洗2次（加满培养孔，倒掉，在滤纸 上扣干）。6）倒去上清加90%冷丙酮室温固定510min,每孔200ul。7）摔去冷丙酮，用pbs洗三次，扣干。在培养板上作好标记（病毒抗原名称，制备时间等）。9）保鲜膜封好,70°c保存。2、bcbl-1细胞的诱导和kshv病毒抗原的制备<1>

7、bcbl-1细胞扩大培养,细胞密度达到50%<2> tpa （120酰佛波醇乙酸酯），每毫升培养液加40ug （ tpa预先配成20mg/ml <3>诱导三天后，收集少量细胞进行icc预实验。<4> kshv阳性细胞达到10%-30%时，可做细胞涂片，阳性细胞>30%时可用于制备病毒细 胞裂解液。<5> kshv阳性细胞达到10%30%时,即可收获细胞加样枪充分吹匀细胞收集于离心管中。<6> 2000转/分离心5-10分钟,弃去上清液。<7>打匀细胞，用pbs洗二次，弃去上清。<8>打匀细胞,加少量pbs

8、液（根据肉眼观察细胞溶液的浊度估计）混匀，取少量在显微镜下计数,调整浓度，估算在玻片上每个细胞涂片圈位（12圈）接种细胞”104个。项目 mcmv hcmv kshv血;青稀释度 1:50 1:100 1:200 1:100 1:500 1:1000 1:50 1 : 100 1:200测血清用二抗hrp-anti mouse igg(fc) sigma或 hrpanti mouse igg+a+m sigma bio-anti mouse igg f(ab' )2 sigma hrp-antimouse igg(fc) sigma或 hrp-anti mouse igg+a+m si

9、gma测上清用二抗 bio-anti mouse igg f(ab# )2 sigma bio-anti mouse igg f(ab' )2 sigmahrp-anti mouse igg(fc) sigma或 hrpanti mouse igg+a+m sigma<9>室温下干燥,然后加100%冷丙酮室温固定3-5分钟,pbst洗二遍。< 10 >室温干燥，作好标记后放入玻片盒玻片盒用塑料袋密封，并放一袋防潮剂,20°c保存，一个月 内有效。三、说明1、测病毒细胞icc血清稀释度及使用的二抗2、细胞病变作用分三种类型1) 全变型：即整个细胞都发生改变。< 1 >整个细胞都发生肿胀，胞浆呈颗粒样变，胞膜边缘不整齐。<2>整个细胞都发生皱缩，变圆直至碎裂，脱落等,多见于病毒。2) 包涵体型：即反映在细胞核或细胞浆内出现病毒弓i起的包涵体。3) 融合型：即指多数病变细胞发生相互事例融合而呈”巨细胞”，但单个细胞的胞核仍可分辨。3、细胞病变程度表示方法通观整个”单层区”权衡总的情况，双下列符号表示其病变程度:无细胞病变+ 25%以下的细胞有病变+ + 25%-50%的