银杏外种皮多糖单糖组成研究

1、银杏外种皮多糖单糖组成研究摘要采用pmp柱前衍生化hplc对水解后银杏外种 皮多糖中的单糖组分进行研究。采用agilent hc-c18色谱 柱 (4. 6 mmx250 mm, 5 卩 m)；流动相 0. 1 mol lt 磷酸 盐缓冲液(ph 6. 8) -乙膳(84 : 16)等度洗脱；柱温40 °c, 流速1 ml min-1,检测波长245 nmo从银杏外种皮多糖水 解液中分析鉴定了 6种单糖，分别为甘露糖、鼠李糖、半乳 糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，其摩尔比为 0. 032 ： 0. 14 ： 0. 296 : 0. 403 : 0. 106 : 0. 046。关键词

2、银杏;多糖;单糖；pmp； hplc收稿日期2013-09-04基金项目江苏省科技发展计划医药高技术研究基金 项目(bg2007609)通信作者*许爱华，教授，tel: e-mail： yzxih21cn. com作者简介茅蕾蕾，硕士研究生，tel: e-胆订：zzlml989126. com多糖的生物活性与其化学结构密 切相关，其单糖组成作为多糖分子昔键的构型、空间结构的 基础对于其肿瘤免疫药理学活性尤为重要。已有的研究显 示，石斛多糖的抗肿瘤活性与该多糖中含有甘露糖和葡萄糖 有关1。从绞股蓝中分离得到的酸性多糖既有抗肿瘤作用, 又可增强免

3、疫活性2。有文献显示，具有抗肿瘤活性的多 糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木 糖以及糖醛酸等组成3。银杏ginkgo kdloba l.系裸子植 物银杏科银杏属种落叶乔木，是我国特有的名贵树种，其叶、 果和外种皮等皆具有药用开发价值，被称为“全身都是宝的 活化石"。银杏外种皮提取物（ginkgo kdloba exocarp extracts, gbee）是从银杏的外种皮中提取的活性组合物， 本课题前期实验研究结果表明，gbee具有显著抗肿瘤作用 4-5,并可促进荷瘤小鼠及ctx损伤小鼠的免疫功能6, 多糖类物质是gbee发挥抗肿瘤及免疫促进作用的主要有效 成分7-

4、9,其平均相对分子质量为11 062. 510,然而对 于其多糖的单糖组成尚不明确。本研究采用pmp柱前衍生化 111hplc对gbee中多糖（以下简称银杏外种皮多糖）的单 糖组成进行分析，为进一步进行相关构效关系研究奠定基 础。1材料1. 1主要仪器与试剂lc-20atvp高效液相色谱仪， spd-20avp紫外检测器，ct0-20ac柱温箱，n2000色谱工作 站（日本岛津公司），bt125d型1/10万电子天平（德国 sartorius公司）。甘露糖（man,批号20120612）、一水合 鼠李糖（rhah20,批号20120708）.葡萄糖（glc,批号 20120723）.半乳糖（g

5、al,批号 20120508）、阿拉伯糖（ara, 批号20120808）. 1-苯基-3-甲基-5-毗哇咻酮（pmp,批号 20111110）均购自国药集团化学试剂有限公司，半乳糖醛酸 （galua,编号111646-200301）购自中国食品药品检定研究 院；乙睛，hplc级（美国tedia公司）。1.2供试品gbee 2012年10月1日从江苏泰兴3个银杏 果园分别采集成熟的银杏，经扬州市药品检验所尹萌主任药 师鉴定为银杏g. biloba科植物的银杏果。由本实验室采用 手工方法将银杏的外种皮与白果分离，将银杏外种皮按1 ：8 料液比加水煎煮，按发明专利方法（专利号20101025105

6、0. 9） 提取分离，将过滤液减压浓缩到一定的浓度后乙醇沉淀，乙 醇终浓度为80%,将沉淀物真空干燥后得灰白色粉末，即 gbeeo经红外光谱分析鉴定，gbee中含蛋白多糖，经苯酚硫 酸法及考马斯亮蓝法测得gbee中蛋白多糖总含量为66. 4%o 本实验对批号为20121108, 20121111, 20121115的3个不 同来源的gbee进行测定。2单糖组成分析方法2.1混合单糖对照品溶液的制备及衍生化精密称取甘露 糖、鼠李糖 一水、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯 糖6种单糖对照品适量，加水制成每iml分别含甘露糖0.06 mg、鼠李糖0. 08 mg、半乳糖醛酸0. 36 mg、葡萄糖

7、0. 25 mg、 半乳糖0.1 mg、阿拉伯糖0. 07 mg的混合单糖对照品溶液。 取该溶液250 p l,加入0. 5 mol lt pmp甲醇溶液250卩l、 0. 3 mol l-lnaoh 溶液 250 u l 涡旋混合 0. 5 min,于 75 °c 反应1.5h,冷却至室温，加入0. 3 mol - l-1hc1溶液250 nl 进行中和，并加入水1 500 pl稀释，摇匀，再加入氯仿5ml 涡旋混匀0.5 min,静置5 min,弃去氯仿液。重复3次后 过0.45 um微孔滤膜。2. 2银杏外种皮多糖的水解及衍生化精密称取gbee粉末 适量置于具塞试管中，加入2

8、mol l-l h2s04溶液2. 0 ml, 于100 °c沸水浴中水解8 h,冷却至室温。用4 mol l-l naoh 溶液中和至ph 7. 0,并以水稀释至8. 0 ml, 1 000 r min-1 离心5 min,取上清液250 ul,按照2. 1项下方法进行衍 生化。衍生化产物存放于4 °c冰箱中，1周内使用。2.3空白对照的制备取水250 pl,按照2.1项下方法 进行衍生化，即得空白对照。2. 4 色谱条件 agilent hc-c18 色谱柱(4. 6 mmx250 mm, 5 um)；流动相0. 1 mol - l-l磷酸盐缓冲液(ph 6.8)-乙

9、購(84： 16)；柱温40 °c；流速1 ml - min-1；检测波长245 nm；进样量50 plo2.5标准曲线制备精密吸取对照品溶液1, 2, 4, 6, 8 ml,分别置于10 ml量瓶中，加水 稀释至刻度，制成系列不同浓度的混合单糖标准溶液。按2. 1 项下方法进行衍生化，2.4项下色谱条件测定。以各单糖对 照品质量浓度(mgl-l)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标 进行线性回归分析，回归方程见表1。表16种单糖对照品线性关系和线性范围table icalibration curve equations and linear range of six monosacchar

10、ides单糖回归方程r线性范围/mg l-l甘露糖y二34 409x+6 271.30. 998 86. 32 63. 2 鼠李糖 y=26 768x-379. 20. 998 98.4884.8半乳糖醛酸丫二28 224x-38 4990. 999 236. 36 363.6 葡萄糖 y=32 632x-104 9150. 999 225.2252 半乳糖 y=37 672x-70 8020. 998 810. 78 107. 8 阿拉伯糖 y=29 403x+25 9370. 999 86. 92-69. 22.6精密度试验取对照品溶液，按2. 1项衍生化，2.4 项下色谱条件连续进样6次

11、，测定甘露糖，鼠李糖，半乳糖 醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖的峰面积，其rsd分别为 0. 60%, 0. 60%, 1.0%, 0. 50%, 0. 60%, 2.7%。2.7重复性试验称取gbee粉末适量，共6份，按2. 2项 下分别进行水解及衍生化处理，按2. 4项下色谱条件进样， 记录色谱峰峰面积，甘露糖，鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖, 半乳糖，阿拉伯糖峰面积的rsd分别为1.0%, 1.0%, 2.8%, 2. 1%, 1.9%, 3. 4%o2. 8稳定性试验称取gbee粉末适量，按2. 2项下分别进 行水解及衍生化处理，按2. 4项下色谱条件分别于0, 2, 4, 6, 8, 12

12、, 24 h进样，记录峰面积，其中甘露糖，鼠李糖， 半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖峰面积的rsd分别 为 1.8%, 1. 2%, 2. 1%, 1. 1%, 1. 8%, 2. 8%o2.9加样回收试验称取已知含量批号为20121111的 gbee粉末约20. 0 mg,共6份，分别加入一定量对照品，按 2. 2项下分别进行水解及衍生化处理，按2. 4项下色谱条件 进样，记录色谱峰峰面积。6种单糖回收率见表2。2. 10样品测定2. 10. 1银杏外种皮多糖的单糖组成测定分别称取3个不 同批次的gbee各20. 0 mg,按2. 2项下分别进行水解及衍生 化处理，按2. 4项下色谱条件

13、进样进行测定，记录峰面积。2. 10.2单糖摩尔比计算参照文献12,按公式(1)计 算样品中各种单糖的比例。nl ： n2 ： n3 ： n4 ： n5 ： n6= (alz xml) / (a1xm1): (a2 xm2) / (a2xm2) : (a3/ xm3) / (a3xm3): (a4 xm4) / (a1xm1) : (a5 xm5) / (a5xm5): (a6 xm6) / (a6xm6) (1)式中nln6分别为样品溶液中单糖的物质的量;al' a6'分别为样品中各单糖衍生物的峰面积；a1a6分别为对 照品中各单糖衍生物峰对应的面积；mlm6分别为对照品中

14、各单糖的质量；mlm6分别为各单糖的相对分子质量。3结果与分析3. 1银杏外种皮多糖的单糖组成及摩尔比混合单糖对照 品与供试品hplc图中的色谱峰分离度良好，空白对照无干 扰，见图13。经与空白及混合单糖对照品hplc图对比， 确定了银杏外种皮多糖水解液衍生物hplc图中的6个单糖 特征峰，分别为甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半 乳糖、阿拉伯糖。表明组成银杏外种皮多糖的单糖中含有这 6种单糖。经计算，上述6种单糖的平均摩尔比分别为 0. 032 ： 0. 14 ： 0. 296 : 0. 403 : 0. 106 : 0. 046。3 个批次的银 杏外种皮多糖各单糖hplc色谱峰峰面积测

15、定结果见表3o表 26种单糖加样回收率(n=6)table 2detemination of the recovery test (n二6)表3银杏外种皮多糖各单糖hplc色谱峰峰面积table 3the resuits of monosaccharides compositionin the polysaccharide from exopleura of ginkgo biloba图1空白对照hplc图fig. 1hplc chromatogram of blankl.pmp； 2.甘露糖；3鼠李糖；4.半乳糖醛酸；5.葡萄 糖；6半乳糖；7阿拉伯糖。图2混合单糖对照hplc图fig 2h

16、plc chromatograms of pmp derivatization of six monosaccharides reference substances1 甘露糖；2.鼠李糖；3半乳糖醛酸；4葡萄糖；5半乳糖；6阿拉伯糖。图3银杏外种皮多糖pmp衍生物hplc图fig.3hplc chromatogram of pmp derivatization of the polysaccharides hydrolysate3. 2gbee水解时间的选择多糖是否水解完全是影响其单 糖含量测定的重要因素。本研究在实验摸索阶段对gbee进 行过2, 4, 6, 8, 10 h等5个不同时间的

17、水解比较研究， 结果显示，水解8, 10 h的gbee水解液中的6个单糖峰面 积达到最大。故本研究正式实验时gbee水解时间选择了 8ho 3. 3衍生化剂量和反应时间的选择衍生化试剂的剂量与反应 时间是衍生化反应的关键。本研究考察了 0. 1, 0.3, 0.5, 0. 7 mol - l-1 不同 pmp 浓度及 30, 60, 90, 120 min 不同反 应时间对单糖衍生物峰面积测定的影响。结果发现，pmp浓 度为0. 1 mol - l-1时，基本检测不到任何一种单糖，pmp浓 度为0.5, 0. 7 mol - l-1时，各单糖峰面积达到最大；反应 时间为90 min时各单糖峰面

18、积达到最大。故本研究选择pmp 浓度为0. 5 mol l-1,反应时间为90 min。3.4色谱柱的选择按2.4项下的色谱条件，分别试用 agilent poroshell 120sb-c18 (4. 6 mmx 150 mm, 2. 7 n m), anient hc-c18 (4.6 mmx150 mm, 5 um)以及 varian microsorb-mv 100-5 c18 (4. 6 mmx 150 mm, 5 pm) 3 种不 同反相色谱柱进行上述6种单糖的分离，结果表明在本实验 条件下，agilent hc-c18色谱柱分离效果好，分析时间短。3. 5缓冲盐及流动相比例的选择

19、缓冲液的ph是影响糖衍 生物分离的一项重要因素。本研究考察了不同ph的磷酸盐 缓冲液对上述6种单糖衍生物特征峰的峰型及分离效果的影 响。结果表明，采用ph 6.8的磷酸缓冲液时峰型较好，分 离效果最佳，出峰时间较短。此外，本实验进一步考察了不 同乙惰比例(14%, 16%, 18%)对上述6种单糖衍生物特征 峰分离效果的影响。结果显示，14%乙睛时阿拉伯糖出峰时 间较长，18%乙睛时6种单糖衍生物整体出峰时间提前，但 半乳糖与阿拉伯糖分离不佳，而乙睛的体积分数为16%时分 离效果较好。因此，确定流动相为磷酸盐缓冲液(ph 6.8) -乙惰(84 : 16)o4讨论糖类物质一般没有紫外吸收，必须

20、采用紫外衍生试剂将 糖衍生化方可用紫外检测器检测。1-苯基-3-甲基-5-毗哇咻 酮(pmp)是一种酸性化合物，可与还原糖的醛基反应，产 生强烈的紫外吸收。honda等13首次将pmp用于糖类物质 的衍生。本研究采用pmp柱前衍生化高效液相色谱法，等度 洗脱14-15,测得组成银杏外种皮多糖的单糖中含有甘露 糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6种 单 糖， 其 摩 尔 比 分 别 为 0. 032 ： 0. 14 ： 0. 296 : 0. 403 : 0. 106 : 0. 046,提示银杏外 种皮多糖是一种酸性杂多糖。采用pmp柱前衍生化高效液相 色谱法分析银杏外种皮多糖的单

21、糖构成及摩尔比，方法简 便，灵敏度高、重复性好，但pmp只能对醛糖进行衍生化， 而对酮糖则不能。本实验室曾采用纸色谱法测得银杏外种皮 多糖水解液中含有果糖16,由于果糖是六碳酮糖，不能被 pmp衍生化，因此本次检测结果未显示银杏外种皮多糖的单 糖组成中含有果糖。致谢该研究得到了扬州市药品检验所尹萌主任药师 的指导与支持。参考文献1 wang j h, luo j p, zha x q, et al. comparison of antitumor activities of different polysaccharide fractions from the stems of dendrob

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