苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒囊膜蛋白GP64与寄主细胞互作蛋白的初步鉴定

1、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒囊膜蛋白gp64与寄主细胞互作蛋白的初步鉴定杨锐冯敏吴小锋浙江大学动物科学学院摘要：鉴定杆状病毒与宿主昆虫细胞间的互作蛋口，对于进一步研究病毒受体的特性 与功能，理解病毒与宿主细胞的相互作用关系具有重要意义。为了阐明苜蓿银纹 夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)出芽型病毒粒子(bv)囊膜蛋白gp64是否与宿 主细胞表面蛋白存在互作，利用蛋白酶k消化处理tn细胞系的细胞膜蛋白，结 果表明bv不能感染经300 n g/m l蛋白酶k消化处理的tn细胞，免疫荧光检测 bv病毒粒子不能吸附于tn细胞膜上。利用病毒覆盖蛋白印迹实验(v0pba)及 质谱初步鉴定的结果显示，tn细胞

2、膜上的翻译控制肿瘤蛋白(tctp)是与bv囊 膜蛋白gp64互作的候选蛋白。关键词：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒;出芽型病毒;gp64蛋白；互作蛋白;作者简介：杨锐(1985),男，博士研究生。e-mail:yrsla.m163. com作者简介：吴小锋，教授，博士生导师。e-mail:wuxiaofengzju. edu. cn收稿日期：2017-04-25基金：国家自然科学基金项目(no. 31472146)identification of host cell protein interacting with envelope protein gp64 of autographa cali

3、fornica multicapsid nucleopolyhedrovirusyang rui feng min wu xiaofengcollege of animal science, zhejiang university;abstract：tdentification of insect cel 1 proteins interacting with baculovirus is of significeint impottancc for furthcr cxploration on charactcristics and functions of virus receptors

4、and for understanding the interaction between virus and host cell. to identify cell membrane proteins interacting with envelope protein gp64 of budded virus ( bv) of autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus ( ac mnpv) , cel 1 membrane protoins of tn cells were digested with protcasc k

5、. the rcsuit revealed that bv could not infect tn cells that had been digested with 300 u g/m l protease k. immunofluorescence assay displayed that bv virus particles could not attach onto tn cell membrane. using virus overlay protein binding assay ( vopba) and mass spectrometry, translational ly_co

6、ntrol led tumor protein ( tctp) of tn cell membrane was preliminarily identified as the candidate protein interacting with envelope protein gp64 of bv.keyword：autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus; budded virus; gp64 protein; tnteracting protein;received： 2017-04-25杆状病毒(baculovirus

7、)是一类特异性感染无脊椎动物的有囊膜包裹的双链 dma病毒，其宿主以昆虫为主1。杆状病毒具有双相生活史，其子代病毒粒子 呈现出2种结构和形态不同的表型，即出芽型病毒(budded virus, bv)和包涵 体衍生型病毒(occlusion-derived virus, 0dv)。在病毒感染早期,病毒核衣 壳在宿主细胞的细胞核内组装后从核膜出芽进入细胞质并最终从被病毒囊膜蛋 白修饰过的细胞膜出芽获得囊膜，形成bv2-3。在感染晚期，核衣壳在细胞核 内获得囊膜形成odv,并在感染极晚期被包埋入多角体2-3 ° bv负责宿主内细 胞与细胞之间的水平传播;odv则是通过宿主昆虫摄入多角体在

8、中肠内被释放并 特异性感染屮肠上皮细胞的方式进行昆虫z间的水平传播。通常，囊膜病毒入侵宿主细胞是以病毒囊膜糖蛋白与细胞表面的受体特异性结 合为起始，受体决定了病毒的宿主域。因此，研究病毒受体的特性及其功能对于 从分子水平阐明病毒侵染与宿主的免疫机制，深刻理解病毒与宿主细胞的相互 作用关系具有重要意义。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(ac mnpv)是目前研究 最为深入的杆状病毒。ac mnpv能够感染棉铃虫、玉米螟等30多种农业害虫，因 此ac mnpv被开发为生物杀虫剂用于防治危害农作物的鳞翅目昆虫，其相对于化 学杀虫剂具有多种优势，如不伤害昆虫天敌，对人畜无害，不污染环境以及具 有后效作用等回

9、。ac mnpv的bv是通过受体介导的内吞作用入侵宿主细胞，bv 的主要囊膜糖蛋白gp64是病毒的受体结合蛋白5-7 o gp64甚至能够介导acmnpv进入多种脊椎动物细胞系，这种特性使得ac mnpv可以作为基因治疗的载 体，通过gp64介导外源基因进入哺乳动物细胞并在细胞内表达宜。因此，鉴定 病毒囊膜蛋白gp64在宿主细胞上的受体或互作蛋白质分子不仅具有重要的基础 科学意义，而且在其应用领域也具有参考价值。近年来，越来越多的病毒受体已被鉴定，且绝大多数受体分子是蛋口质，这可 能是因为蛋白质分子具有复杂的多样性空间结构，具有作为受体分子的结构基 础。ac mnpv作为研究最为广泛和深入的杆

10、状病毒模式种，其绝大多数基因功能 已经比较清处，病毒与宿主互作的分子机制正在逐渐被揭示。然而在ac mnpv 的bv蛋片受体研究方面却进展缓慢，这可能因为ac mnpv的宿主域较为广泛，bv 能够进入多种细胞。有研究报道，细胞膜蛋口在ac mnpv入侵细胞中可能具有重 要作用，但却未有直接证据表明ac mnpv与细胞膜蛋白间的相互作用童1。因此 有观点认为bv入侵细胞并不依赖于与受体的互作也l越来越多研究表明，细 胞膜中的脂质可与gp64发生相互作用，这一过程在bv入侵细胞过程中具有重要 作用11。tani等曲研究发现gp64与哺乳动物细胞表面磷脂质的结合过程在 病毒进入细胞中发挥重要作用，不

11、论是用磷脂酶c处理细胞，还是用纯化的磷 脂质孵育病毒，都会降低以gp64为囊膜蛋白的假型病毒进入细胞的效率。用甲 基- b -环糊精去除哺乳动物细胞膜中的胆固醇可以阻断ac mnpv进入哺乳动物细 胞，却并不能阻止病毒对于细胞的吸附过程1131。近期的研究发现，乙酰肝素被 鉴定为可与gp64互作的哺乳动物细胞膜蛋白，乙酰肝素对于病毒吸附并进入哺 乳动物细胞的过程是必需的，但是用纯化的乙酰肝素孵育过后，ac mnpv却仍能 高效地感染sf9昆虫细胞系，说明gp64可能利用其他结合方式入侵昆虫细胞 14 o迄今为止，ac mnpv的bv囊膜蛋白gp64在昆虫细胞上的互作蛋白质分子仍未被 鉴定，其至

12、不能确定互作分子是否为蛋白质，因此首先需要明确在感染宿主的 细胞表面，是否存在与杆状病毒互作的蛋口质分子。本研究利用蛋口酶消化昆虫 细胞膜，确定细胞膜上存在与gp64互作的蛋白质，并进一步利用病毒覆盖蛋白 印迹实验(virus overlay protein blot assay, vopba)和质谱分析鉴定细胞 膜上与bv gp64互作的候选蛋白质。1材料与方法1.1材料和主要试剂可表达绿色荧光蛋白(egfp)的ac mnpv病毒ac-egfp由本实验室构建，tn细 胞由木实验室继代保存。gp64单克隆抗体购自sigma公司，罗丹明标记羊抗鼠 二抗和hrp标记羊抗鼠二抗购自杭州华安生物技术有

13、限公司，蛋白酶k购自ta kara公司，细胞膜蛋口提取试剂盒和ecl化学发光底物购自thermo fisher公 司，0.4%台盼蓝溶液购自碧云天生物技术有限公司，硝酸纤维素膜购自whatman 公司。1.2蛋白酶k对细胞膜蛋白的消化处理 将1 x 10个tn细胞转移到直径为35 imn的细胞培养皿中，27°c培养过夜使细胞 贴壁。吸去血清培养基，用无菌pbs缓冲液冲洗细胞3次（5min/次）。用无菌 pbs缓冲液稀释蛋白酶k至50、100、150、200、250和300 n g/m l共6个终浓 度，分别加入到各个细胞培养皿屮，37°c孵育30 mine然后加入蛋口酶抑制

14、剂 终止反应，吸去上清，用无菌pbs缓冲液冲洗细胞3次（5 min/次）。1. 3细胞活力测定适当稀释制备tn细胞悬液。向细胞悬液中加入0.4%台盼蓝溶液，使台盼蓝终浓 度为0.04%。在3min内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，死细胞被染成 淡蓝色，计算活细胞在总细胞屮所占比率。要求在3 min内完成死细胞计数，以 免部分活细胞tn被染色，影响实验的准确性。1.4病毒对细胞的吸附实验吸去tn细胞培养皿中的上清，加入病毒上清，4°c温和振荡孵育lh。吸去上清, pbs缓冲液冲洗3次（5 min/次），加入2. 5%多聚甲醛室温下固定20mino弃上 清，pbs 冲洗 3 次（5

15、min/次）,加入 0. 5%triton x-100,放置 15 min。弃上 清，pbs冲洗3次（5min/次），加入以1 ： 200体积比稀释的gp64抗体，室温 下孵育1 ho弃上清，pbs冲洗3次（5 min/次），加入1 ： 500体积比稀释的罗 丹明标记羊抗鼠二抗，室温孵育45 mine弃上清，pbs冲洗3次（5 min/次），加 入dapi染核，弃上清，pbs冲洗3次（5 min/次），最后观察荧光。1.5 bv病毒粒子的分离纯化参照文献15,以m0i二0. 1的病毒液感染tn细胞，感染后120 h收集上清。上 清9 000 r/min离心20 min,至少重复3次，以去除残留

16、的细胞碎片。随后病 毒上清在4°c条件下100 000 g离心90 min,管底的黄色沉淀即为bv病毒粒子。 将沉淀重悬于0. 5 m l 0. 1xte溶液中，将病毒悬液平铺到250560 g/l蔗糖-10 mmol/l tris-ilcl （p ii 7. 5）密度梯度溶液的顶部,4°c条件下100 000 g离心 90 min,收集白色的病毒粒子带。加入4倍体积预冷的0. 1xte溶液洗涤2次，每 次洗涤完毕后均在4°c条件下100 000 g离心90 min,弃上清，最后用0. 2 m l 的0. 1xte溶液重悬病毒粒子，-20°c保存备用。1

17、.6 tn细胞膜蛋白的提取用细胞刮棒将约5x10个tn细胞从培养皿表面刮下，细胞悬液300 g离心5 min, 收集细胞，弃上清。pbs缓冲液重悬细胞沉淀，300 g离心5 min,重复3次。 按照膜蛋白提取试剂盒说明书加入裂解液混匀，4°c孵育10 mine 4°c条件下16 000 g,离心15 min,弃上清,加入增溶缓冲液重悬沉淀，4°c孵育30 min。再 于4°c条件下16 000 g离心15 min,上清即为细胞膜蛋白。吸取上清至新的离 心管屮，-80°c保存备用。1.7病毒覆盖蛋白印迹实验（v0pba） 对tn细胞的膜蛋白进行s

18、ds-page电泳分离，再将细胞膜蛋白转印至硝酸纤维素 膜（7c膜）上。参照文献的方法，将转印有细胞膜蛋白的nc膜用含2%牛血 清白蛋白的pbs溶液封闭30 min,随后加入纯化的bv病毒粒子，4°c温和振荡 孵育过夜。弃上清，用pbst缓冲液冲洗3次（5 min/次），加入1 ： 1 000体积 比稀释的gp64鼠单抗,室温孵育lh。弃上清，pbst冲洗3次（5 min/次），加 入1 ： 5 000体积比稀释的hrp标记羊抗鼠二抗，室温孵育45 min。弃上清，pbst 冲洗3次（5 min/次）。加入ecl化学发光底物，胶片曝光。1.8细胞膜蛋白的质谱鉴定对tn细胞的膜蛋口进行

19、sds-page电泳分离，考马斯亮蓝染色，比对v0pba实验 结果将相应的条带分别割下，分别转入无菌离心管中，对其进行酶解。采用 4800 plus maldi tof/tof串联飞行时间质谱仪（美国abi公司）对蛋白质酶解 后的样品进行鉴定。2结果与分析2.1蛋白酶k消化细胞膜蛋白阻断病毒对tn细胞的感染使用不同浓度的蛋白酶k孵育tn细胞，使蛋白酶k消化处理细胞膜蛋白，然后 以moi二10的感染剂量接种病毒（ac-egfp） , 24 h后观察细胞被感染的情况。 结果显示，用质量浓度为50 u g/m l的蛋白酶k消化处理细胞后，在荧光显微镜 下可观察到大部分细胞能够被ac-egfp感染发岀

20、绿色荧光，用facs cali bur流 式细胞仪（美国bd公司）检测荧光细胞的比率发现，荧光细胞比率（细胞感染 率）接近100%;当蛋白酶k质量浓度上升至150 y g/m l时，接种病毒后大部分 细胞仍然能够被感染；直到蛋白酶k质量浓度达到200 m g/m l时，细胞感染率才 下降至49%;当蛋白酶k质量浓度达到300 y g/m l时，细胞感染率下降至9. 7% （图1-a和图1-0 o为了确认蛋口酶k消化细胞导致感染率下降不是因为细胞活力下降造成的，我 们对蛋白酶k消化处理的tn细胞活力进行测定。结果显示，用蛋白酶k消化处 理细胞并没有导致细胞活力显著下降（图1-b）。这些结果说明，

21、蛋白酶k消化 处理细胞膜蛋白阻断了病毒感染细胞，初步确认了 tn细胞膜蛋白在病毒感染过 程屮的关键作用。2. 2蛋白酶k消化细胞膜蛋白阻止bv病毒粒子吸附tn细胞膜的作用为了确认蛋白酶k消化细胞膜蛋白阻断病毒感染tn细胞的原因是否是因为病毒 粒子无法吸附细胞膜造成的，我们用bv病毒粒子与蛋白酶k消化处理后的tn 细胞在4°c条件下孵育1 h,然后用pbs缓冲液冲洗掉未吸附在细胞膜上的病毒 粒子，再用gp64抗体和罗丹明标记羊抗鼠二抗检测吸附在细胞膜上的病毒粒子, 通过观察红色荧光判断病毒粒子的吸附情况。结果显示，未经蛋口酶k消化的 tn细胞明显可以观察到病毒粒子吸附在细胞膜上，而用3

22、00 ng/ml蛋白酶k消 化后的tn细胞，病毒粒子则无法吸附到细胞膜上（图2） o这些结果说明，蛋 白酶k消化细胞膜蛋白阻止了病毒吸附细胞膜，进一步确认了 ac mnpv的囊 膜蛋白gp64在tn细胞膜上的互作分子是蛋白质。活细胞比率/ % rate of live cells0 50 100 150x閉口bk)二匚protease图1用蛋白酶k消化细胞膜蛋白阻断ac-egfp病毒感染tn细胞的效果fig. 1 effects of blocking the virus ac-egfp from infecting tn cells by digesting cell membrane pr

23、oteins with protease k 卜载原图a.病毒感染不同浓度蛋白酶k处理细胞的观察b.不同浓度蛋白酶k处理后的细 胞活力c.不同浓度蛋口酶k处理后细胞的感染率a. infection of tn cells digested with different concentrations of protease k by ac-egfp b. cell viability after treatments by different concentrations of protease k c. infection rates of cel 1s digested with diffe

24、rent concentrations of protease k.gp64抗体anti-gp64对照controlgroup蛋白酶k处理treatment withprotease k10 pim图2用300 n g m l蛋白酶k处理tn细胞后bv病毒粒子对细胞的吸附观察fig. 2 observation on attachment of bv virus particles onto tn cells digested with 300 m g m lprotease k 下载原图2. 3 tn细胞膜上与bv囊膜蛋白gp64的互作蛋白分子鉴定提取tn细胞膜蛋白，通过sds-page电泳

25、分离后转卬至nc膜上，将其与纯化的 bv病毒粒子孵育，然后用gp64抗体检测病毒粒子。结果显示，bv病毒粒子可以 结合到3个细胞膜蛋白的条带上，它们的分子质量分别是44 k d、27 k d和19 k d (图3)。从tn细胞膜蛋口 sds-page电泳凝胶相对应的位置切下蛋口质条 带进行质谱鉴定，44 k d和27 k d的条带被鉴定为肌动蛋白(actin) , 19 k d 的条带被鉴定为翻译控制肿瘤蛋白(translationally-controlled tumor protein, tctp),结果见表1。这些结果证明在tn细胞膜上存在与ac mnpv的 bv互作的蛋白质分子。而为何

26、在电泳凝胶中分子质量差异明显的2个条带都被 鉴定为actin,推测可能是在蛋口质提取过程屮由于体内或体外的因素，导致 actin发生剪切或降解。i n mkd55433426 图3病毒覆盖蛋白结合实验鉴定tn细胞膜上与bv病毒粒子囊膜蛋白gp64的互 作蛋白 fig. 3 identification of tn cell membrane proteins interacting with bv virus particles using virus overlay protein binding assay 下载 原图sf9细胞蛋口(泳道i)、tn细胞蛋白(泳道ii)、病毒感染sf9细胞蛋

27、白(泳 道iii)和病毒感染tn细胞蛋白(泳道iv)通过10%的sds-page电泳分离，然后 转卬至硝酸纤维素膜上，gp64抗体检测作为对照。sf9细胞(泳道v)和tn细 胞(泳道vi)细胞膜蛋白通过10%的sds-page凝胶电泳分离，然后转印至硝酸 纤维素膜上。纯化的bv病毒粒子覆盖膜上，互作蛋白条带以gp64抗体检测。在 泳道v未见条带，在泳道vi可见3个条带。泳道vii是蛋口质分子质量markero 相应的sds-page电泳凝胶(泳道训)经考马斯亮蓝染色后，将对应的3个条带 切下进行质谱分析。proteins from sf9 cells ( i ) , from tn cells

28、 (11) , from sf9 cel 1 s inf ected by virus (iii) , and from tn cel is in fected by virus (iv) were isolated bylo%sds-page and transferred onto nitrocellulose membrane. nitrocellulose membrane was detected by gp64 antibody. cell membrane proteins from sf9 cells (v) and tn cells (vi) were isolated by

29、 10%sds-page and transferred onto nitrocellulose membrane. purified bv virus particles were overlaid on the membrane. the interacting proteins were detected by using gp64 antibody. no band was seen in lanev (sf9), and three bcinds were seen in lanevi (tn) umevhwas the protein moleculeir weight marke

30、r. coomassie blue stain profile (viii) of a similar gel electrophoresis was used to excise the corresponding bands for mass spectrometric analysis.表1病毒覆盖蛋白结合试验鉴定的3个细胞膜蛋白条带的质谱分析信息table 1 mass spectromctrie analysis of 3 membrane protcins identificd with virus overlay protein binding assay下载原表分子质量/ kd

31、molecular weight鉴定蛋白质4identified proteii44肌动蛋白a2719肌动蛋白a翻译控制肿瘤translalionally-<x)ntrolle(l tu3讨论目前为止被确认的病毒受体分子绝大多数为蛋白质。为了确认ac mmpv的bv感 染是否与细胞表面蛋口质有关，本研究用蛋口酶k消化tn细胞，破坏其细胞膜 蛋白，观察这一处理过程能否降低bv对tn细胞的感染率。当使用质量浓度 <200 u g/m l的蛋白酶k消化处理细胞后，病毒粒子对细胞的感染率接近100%; 蛋白酶k的质量浓度>200 h g/m l,病毒粒子对细胞的感染率呈现下降趋势;当

32、消 化处理使用的蛋白酶k质量浓度达到300 u g/m l,几乎阻断了病毒对细胞的感 染。显然细胞膜上膜蛋口的量与细胞对于病毒的易感性成正相关。这些结果初步 证明膜蛋白在bv入侵细胞过程中具有重要作用。有趣的是，当细胞被300 u g/m l的蛋白酶k消化处理后，经过72h的培养生长，细胞的感染率乂重新达到 100%。我们推测，因为蛋白酶k消化并没有影响细胞活力，经过72h的生长，细 胞又重新合成细胞膜蛋白并展示于细胞表面，恢复了对于病毒的易感性。通过免疫荧光实验观察细胞膜上的病毒粒子吸附状况，结果显示蛋口酶k消化 细胞膜蛋白后阻碍了 bv病毒粒子对细胞的吸附。由此可见，细胞膜蛋白的完整 性受

33、到破坏后，严重影响了病毒粒子与细胞表面蛋白质分子的相互作用，进一 步证明bv囊膜蛋白gp64的互作分子之一是细胞膜蛋白o vopba实验鉴定到在tn 细胞膜蛋白中，直接与gp64发牛相互作用的是分子质量分别为44 k d、27k d 和19kd的蛋片质条带，质谱鉴定分别是actin和tctp蛋白。值得思考的是，同 样是ac mnpv的易感细胞，sf9的细胞膜蛋口并未通过vopba的方法检测到结合 条带。分析原因可能是因为vopba方法的缺点在于只能检测单一多肽分子与病毒 的互作，如果与病毒互作的蛋白质是复合体或蛋白质在处理过程中丧失活性， 则很可能就无法用此方法检测到互作蛋白。因此，并不能就此

34、排除sf9细胞膜中 存在与病毒发生相互作用的蛋白质的可能性。actin是胞浆蛋白，但是在细胞膜提取物屮也被鉴定到，表明提取方法并不能 完全将脂溶性的膜蛋口和水溶性的胞浆蛋口彻底分开。有充分的证据表明，在 bv囊膜与细胞膜融合，核衣壳进入细胞质过程中，定位于核衣壳末端的衣壳蛋 白pp78/83可以通过激活arp2/3复合物的途径导致actin聚集从而使杆状病毒 核衣壳获得运动能力，这一作用在杆状病毒核衣壳由细胞质转运到核衣壳的过 程中起到重要作用17-18。actin在病毒核衣壳组装和转运过程屮也具有重要 作用19。但是，显然actin不太可能定位于细胞膜上并具有病毒受体的功能。tctp是一类在

35、进化中高度保守、在细胞内含量丰富的管家蛋白。tctp在多个生 物学进程中具有重要作用，包括细胞增殖、免疫反应、细胞凋亡、细胞恶性转化 等等，它可与细胞中的多种蛋白质，诸如x射线修复交叉互补蛋白(x-ray repair crosscomplcmcnting 6, xrcc6)、b-肌动蛋口(b pctin, actb)、 微管蛋白(tubulin alpha lc, tl'baic)、热激蛋白(heat shock protein 70, hsp70)等结合发生和互作用20。据报道，tctp蛋白的n端包含一段具有细胞 穿透功能的疏水序列，此序列名为蛋白转导功能域(protein tra

36、nsduction domains, ptd) 21。ptd 又名细胞穿透多肽序列(cel 1 -penetraxin peptides, cpp),在多种蘇及病毒蛋口质屮都有出现，其功能为促进蛋口质分子穿过细 胞膜进入细胞或组织，研究显示tctp的ptd序列引导绿色荧光蛋白egfp通过内 吞作用进入细胞，因而可观察到细胞发出的绿色荧光陛1。如前所述，ac mnpv 的bv病毒粒子入侵细胞也是通过gp64与受体分子互作介导的内吞作用。因此， bv与tn细胞膜结合后，是否通过由gp64和tctp互作介导的内吞作用进入细胞, 需要进一步的研究。而tctp的高度保守性也初步解释了为何ac mnpv的

37、bv病毒 粒子能够进入包括哺乳动物细胞在内的多种细胞。综上所述，ac mnpv的bv囊膜蛋白gp64与tn细胞膜蛋白存在互作，并通过vopba 以及质谱的方法鉴定到tctp是候选的细胞表面的互作蛋白。本研究对杆状病毒 感染宿主细胞时与细胞表面蛋白的相互作用进行了初步探索，丰富了杆状病毒 gp64蛋白与受体的相互作用机制的研究信息。参考文献1theilmann d a, blissard g w, bonning b, et al.baculoviridaem/fauquet c m, mayo m a, ma7il0ff j, et al.virus taxonomy-eighth repor

38、t of the international committee on taxonomy ofviruses. san dicgo:elscvicr academic press, 2005:1129-11852 granad0s r r, lawler k a. in vivo pathway of autographacalifornica baculovirus invasion and infectionj.virology, 1981, 108 ：297-3083 keddie b a, aponte g w, volkman l e.the pathway of infection

39、 of autographs californica nuclear polyhedrosis virus in an insect hostj.science, 1989, 243 (4899) :1728-17304 r0driguez v a, belaich m n, ghiringheli p d. baculoviruses:members of integrated pest management strategiesm/larramendy m l, s0l07eskis. integrated pest memagement and pest controlcurrent a

40、nd future tactics. rijeka:in tech, 2012:463-4805 d0ng s, wang m, qiu z, et al.autographa californica multicapsid nucleopolyhedfovirus efficiently infects sf9 cells and transduces mammalian cells via direct fusion with the plasma inembrane at low p hj. j virol, 2010, 84 (10) :5351-53596 heffer0n k l,

41、 oomens a g, monsma s a, et al. host cell receptor binding by baculovirus gp64 and kinctics of virion entryjvirology, 1999, 258 (2) :455-4687 m0nsma s a, blissard g w. identification of a meiiibrane fusion domain and an oligomerization domain in the baculovirus gp64 envelope fusion protcinjj virol,

42、1995, 69 (4) :2583-25958 h0fmann c, sandig v, jennings g, et alefficient genetransfer into human hepatocytes by baculovirus vectotsj. proc natl acad sci usa, 1995, 92 (22) :10099-101039 wang p, hammer d a, granados r rbinding and fusion of autographa californica nueleopolyhedrovirus to cultu:red ins

43、ect cellsj j gen virol, 1997, 78 (12) :3081-308910 katayama h, nagasu t, oda y. imptoveiiient of in-gel digestion protocol for peptide mass fingerprinting by matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometryj.rapid commun mass sp, 2001, 15 (16) :1416-142111 o'flynn n m,

44、 patel a, kadlec j, eta i. 1 mpro vin g promiscuous mammalia n cell entry by the baculovirus autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virusj.biosci rep, 2013, 33 (1) :23-2612jtani h, nishijima m, ushijima h, et al. characterization of cel1-surface determinants importanl for baculovirus i

45、nfcctionj.virology, 2001, 279 (1) :343-35313 kata0ka c, kaname y, taguwa s, et al baculovirus gp64-mediated entry inlo mammalian cellsj.j virol, 2012, 86 (5) :2610-262014 wu c, wang s. a p h-sensitive heparin-binding sequence from baculovirus gp64 prote in is imports nt for binding to mamnieiliem cells but not to sf9 insect cellsjj virol, 2012, 86 (1) :484-49115 braunagel s c, sum