革兰氏染色法

1、革兰氏染色法(Gram's stain)是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。 【原理】细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。【材料】【方法】按涂片干燥固定染色镜检的顺序进行。准备载物玻片：用镊子从载物片

2、缸中取出经3盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.52.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。1涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下：用肉汤培养物涂片： 右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。 将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧红(图1-2)，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。 用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。 用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1-3)，此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。 将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间

3、要短以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。 将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。用斜面培养物涂片：用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。2干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。3固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标

4、本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。4染色：将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min。水洗后加芦戈氏碘液处理(媒染)1min。水洗后用95酒精脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体无色为止(约需0.5min)。水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5min。水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。染色过程中，水洗要用自来水的细流徐徐冲洗，冲洗涂膜的背面，勿使强水流直接冲到涂膜上。【结果观察】使用油镜观察，注意标本中两种细菌的形态、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪种细菌是革兰氏阳性菌(染成紫色)，哪种细菌是革兰氏阴性菌(染成红色)。将在标本中观察到的细菌形态和染色性

5、，用有色铅笔画出模式图，并附以文字说明。注意事项：酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在1824h之内。1革兰氏染色液的制备结晶紫染液用天秤量取结晶紫5g放乳钵内研碎，一面研磨一面徐徐加入95酒精使之溶解。加入酒精全量为100m1，制成酒精饱和液(原液)。取原液2

6、0ml，与1草酸铵水溶液80ml混合，用滤纸过滤。供革兰氏染色初染用。芦戈氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300ml配法是先用数毫升蒸馏水溶解碘化钾，然后加碘使其全溶解，最后加蒸馏水至300ml。供革兰氏染色媒染用。稀释石碳酸复红染液取碱性复红10g和95酒精100ml，按上述方法同制成复红酒精饱合液。取复红饱和液10ml，与5石碳酸水溶液90ml混合，用滤纸.过滤，再用蒸馏水稀释10倍。供革兰氏染色复染用。细菌的特殊染色技术芽孢染色 荚膜染色 鞭毛染色一目的要求： 学习掌握芽孢、荚膜和鞭毛染色原理和方法。 二原理：   芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的

7、染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。   观察荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。   观察鞭毛是采用在染色的同时将染料堆积在鞭毛上使它加粗的方法。细菌只有在个体发育到一定的时期才具有鞭毛，一般在多次移种之后，在其旺盛生长阶段染色。 三实验材料： 1菌种：巨大芽孢杆菌(B.megaterium)：营养琼脂斜面培养20hs   &

8、#160;   产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)：肉汁等斜面培养20hs       普通变形杆菌(Proteus vulgaris)：营养琼脂斜面培养18hs 2染料： （1）芽孢染色用7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝     液） （2） 荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。 （3） 鞭毛染色用硝酸银染色液（A、B液）;或Leifson染色液（A、B、C液） 3其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、     1%盐酸、电炉、

9、墨汁、20%CuSO4、95%乙醇、擦镜纸等。 四实验方法与步骤： （一） 芽孢染色：介绍两种常用的方法 1. 孔雀绿染色法：取一干净载片按无菌法取巨大芽孢杆菌菌体少许制成涂片，     风干固定后，在涂菌处滴加法7.6%的孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后，     用水冲洗，再用0.5%蕃红花红液染色彩1分钟，水洗，风干后镜检。芽孢     被染成绿色，营养体呈红色。 2.石炭酸复红染色法：在一支小试管（10*100mm）中，滴入34滴蒸溜水，用接种环取巨大芽孢杆菌于水中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。然后滴加等体积的(3

10、4滴) 石炭酸复红掖摇匀。将此试管放入沸水浴中煮1015分钟，使芽孢及菌体着色。取此菌液体23环在洁净的载片上做成涂片，自然干燥通过火焰固定后，在自来水下缓缓冲洗，使菌体脱色，再用吕氏美蓝液复染12分钟。用水洗去多余染液，轻轻用吸水纸吸去水分，干后镜检，结果可见芽孢被染成红色，菌体呈现蓝色。 （二）荚膜染色法 1.方法 将刚果红水溶液和明胶水溶液各一滴滴于干净载片上；用接种环蘸取细菌培养液或悬浮液在载片上于上述两滴溶液混匀，自然干燥；滴加1%HCl冲洗，使涂片呈蓝色；用蒸馏水漂洗，除去HCl；，用美蓝复染1分钟，水洗，自然干燥后镜检。   镜检：有荚膜的菌，菌体蓝色，荚膜不着色，背景

11、蓝紫色；无荚膜的菌，菌体蓝色，背景蓝紫色。由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能有一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜。荚膜不着色的部分宽。 2.方法 湿墨汁法 （1）制菌液：加一滴墨汁于洁净的波片上，并挑少量菌与其充分混合。 （2）加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下 轻压，吸收多余菌液。 （3） 镜检。     结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 3. 方法TyLer法 （1） 涂片：按常规法涂片，在空气中自然干燥。 （2） 染色：用结晶紫冰醋酸染57分钟。 （3） 用20%CuSO4水溶液洗，再用毛边纸吸干。 （4） 镜检

12、并观察结果：荚膜蓝紫色，细胞暗蓝色。 （三鞭毛染色法 1.银盐染色法 （1）清洗玻片: 选择光滑无裂痕的玻片,最好选用新的。为了避免玻片向后重叠，应将玻片插在专用金属架上。然后将玻片置洗衣粉滤过液中（洗衣粉先经煮沸，再用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20分。取出稍冷后即用自来水冲洗，晾干。再放入浓洗液中浸泡56天。使用前取出玻片，用水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。取出玻片，在火焰上烧去酒精，立即使用。 （2）菌液的制备及涂片：用于染色的菌种应预先连续移接5至7代。染色前用于 接菌的培养基应是新鲜制备的，表面较湿润，在斜面底部应有少许冷凝水。 将变形杆菌接种于肉汤斜面

13、上，在适宜的温度下培养15至18小时后，用接 种环挑取斜面底部菌苔数环，轻轻地移入盛有1毫升与菌种同温的无菌水 中，不要振动，让有活动能力的菌游入水中，呈轻度混浊。在最适温度下保 温10分钟，让老菌体下沉，而幼龄菌体在无菌水中可松开鞭毛。然后从试管 上端挑数环菌液，置于洁净玻片的一端，稍稍倾斜玻片，使菌液缓慢地流向另一端。置空气中自然干燥。 （3） 染色： 滴加A液，染4至6分钟。 用蒸馏水轻轻地充分洗净A液。 用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在微火上加热至冒蒸汽，约维   持0.5至1分钟（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干   涸部分）。 用蒸馏水洗，干燥

14、。 镜检     结果：菌体和鞭毛呈深褐色至黑色。2. Leifson 染色法 （1） 清洗玻片法同1。 （2） 菌液的制备及涂片 菌液的制备同1 用削尖腊笔在洁净玻片上划分3至4个相等的区域。 放一小环菌液于每一区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端。在另一端用一张吸水纸吸去多余的菌液。 涂片在空气中自然干燥。 （3）染色 加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后染料加入第二区，以后依此类推（相隔时间可自行决定），其目地是由于染色时间长短受菌种、室内温度、湿度等因素的影响。这样便于确定最合适的染色时间，且节省材料。 在染色过程中要仔细观察。当整个玻片出现铁锈色沉淀和染

15、料表面出现金色膜时,就可用水轻轻地冲洗,一般约10至15分钟. 水洗:在没有倾去染料的情况下就用自来水轻轻洗去染料,否则会增加背景的沉淀。 自然干燥。 镜检。 结果：细菌和鞭毛都染成红色。 八染色液附录：     1硝酸银染色液       A液：丹宁酸     5克     FeCl3   1.5克             蒸馏水     100毫升         待溶解后

16、，加入1% NaOH溶液1毫升和15%甲醛溶液2毫升。   B液：硝酸银     2克   蒸馏水   100毫升       待硝酸银溶解后，取出10毫升做回滴用。往90毫升B液中滴加浓 NH4OH溶液，当出现大量的沉淀时再继续加氢氧化氨，直到溶液中沉淀刚刚消失变澄清为止。然后用保留的10毫升B液小心地逐滴加入，至出现轻微和稳定的薄雾为止（此操作非常关键，应格外小心）。       在整个滴加过程中要边滴边充分摇荡。配好的染色液当日有效。4 小时内效果最好。   2Leif

17、son染色液 A液：碱性复红   1.2克     95%乙醇     100毫升 B液：丹宁酸     3克     蒸馏水       100毫升     如加0.2%苯酚，可长期保存。 C液：NaCl     1.5克     蒸馏水       100毫升     染色液贮与磨口瓶中。在室温下较稳定。使用前将上述溶液的等体积混合。此混合液贮于密封性良好的瓶中置于冰箱可保存数星期。在较高温度下会因混合液发生化学变化而使着色力日益减弱。书是我们时代的生命