苏氨酸产生菌的鉴定、诱变选育及其发酵条件优化

1、一株L-苏氨酸产生菌的鉴定、诱变选育及其发酵条件优化 一、研究的目的及意义 二、研究的内容与方法 三、研究结果 四、展望一、研究的目的及意义L-苏氨酸是必需氨基酸之一，用途广泛：食品：作为营养增补剂，可恢复人体疲劳、 促进生长发育饲料：作为饲料添加剂，调整饲料氨基酸平 衡、促进生长、改善肉质 医药：配置复合氨基酸输液、 制造单酰胺菌素的原料 目前，全球苏氨酸的需求量要明显大于其总产量，而且缺口很大。 我国苏氨酸工业发展稍晚，21世纪初国内苏氨酸年需求量仅为千吨，2009年接近2万吨。21世纪初期，我国苏氨酸还主要依赖于进口，所以，苏氨酸生产具有很大的发展潜力。二、研究的内容与方法（一）L-苏氨

2、酸产生菌的鉴定1. 形态学特征观察 主要包括菌落的形态、细胞个体的形态、大小、排列、运动性、特殊构造和染色反应等。 形态学鉴定结果：革兰氏阳性，菌落呈圆形，黄色，无芽孢，有运动性图1.WS4006-7E的菌体形态 图2.WS4006-7E革兰氏染色结果 2. 生理生化特征鉴定测定项目WS4006-7E测定项目WS4006-7E氧化酶-果糖+接触酶+乳糖-硝酸盐还原+木糖-明胶液化-阿拉伯糖-甲基红+葡萄糖+V-P-麦芽糖+脲酶-山梨醇+脂酶+甘露醇-淀粉水解-H2S生成-蔗糖+KCN生长-表1.生理生化特征鉴定结果 根据形态学特征和生理生化特征鉴定结果，还不能确定WS4006-7E菌株的名称，

3、近年来，由于分子生物学技术的发展，16SrDNA序列测定被认为是最适细菌系统发育和分类鉴定的指标。所以，又对菌株进行了分子学上的鉴定。3.分子鉴定 WS4006-7E经PCR扩增出的16SrDNA得到的全序列为1508bp，根据WS4006-7E的序列比对分析和所构建的系统发育树，结果表明WS4006-7E与Stenotrophomonas maltophilia的亲缘关系较近，但由于未在同一个最小分支中，所以很难将其定为嗜麦芽寡养单胞菌，所以鉴定结果为该菌为和嗜麦芽寡养单胞菌亲缘关系非常近的一种新菌种。（二） L-苏氨酸产生菌的诱变选育 原理：根据微生物的生物合成途径以及代谢控制发酵技术，通

4、过诱变育种，获得各种遗传变异菌株，从而打破正常的代谢产物合成途径和代谢调节机制，人为地使目的产物大量合成和积累。 本文以L-苏氨酸产生菌WS4006-7E为出发菌株，经亚硝基胍、紫外线和硫酸二乙酯逐级诱变，定向选育出一株带有带有Met-+Lys-+Ile-遗传标记的L-苏氨酸高产菌。选育系谱 L-苏氨酸产量（g/L）WS4006-7E 2.980 NTG诱变WS4006-7E-N-37（Lys-） 3.536 UV诱变 WS4006-7E-NU-23 （Lys-+ Met-） 4.458 DES诱变WS4006-7E-NUT-21（Lys-+ Met-+Ile-） 5.679（三）L-苏氨酸发

5、酵条件优化1.正交实验设计优化种子培养基 选取种子培养基的四大主要成分：葡萄糖（A）、玉米浆（B）、硫酸铵（C）、酵母膏（D），进行四因素三水平的正交实验。 L-苏氨酸产量（g/L）总和实验号ABCD12111115.365.4610.82212225.685.711.39313335.055.0810.13421234.874.919.78522315.335.0310.36623125.735.7211.45731324.814.799.60832135.125.0810.20933215.445.5510.99T132.3430.2032.4732.17T231.5931.9532.16

6、32.44T330.7932.5730.0930.11R1.552.372.382.33正交试验安排表及试验结果 从上表可以看出，这四个因素的最优水平为A1、B3、C1、D2 ，因此，根据实验结果可确定出种子培养基的最佳种子配比。 正交试验所确定的最佳条件并未包含在九个实验中，为了进一步确定实验结果，采用最佳条件进行验证。摇瓶序号12345平均L-苏氨酸产量（g/L）5.835.755.635.765.785.75验证实验结果 2.单因素实验设计优化种子培养基3. 单因素实验设计优化发酵培养件4. 发酵培养基的优化（1）碳源、氮源的选择（2）葡萄糖、硫酸铵的添加量对发酵产酸的影响（3）均匀设计

7、优化发酵培养基序号玉米浆磷酸盐硫酸镁硫酸亚铁硫酸锰碳酸钙1100.60.150.0060.006102150.80.20.0080.0081532010.250.010.01204251.20.30.0120.012255301.40.350.0140.014306351.60.40.0160.01635六因素水平表（g/L） 序号玉米浆X1磷酸盐X2硫酸镁X3硫酸亚铁X4硫酸锰X5碳酸钙X6L-Thr产量1100.80.250.0120.014355.422151.20.40.0060.01304.353201.60.20.0140.006255.634250.60.350.0080.016

8、207.1453010.150.0160.012157.56351.40.30.010.008106.92发酵培养基均匀设计试验方案及试验结果（g/L）变量回归系数F值7.250X2*X20.40521.611X3*X3-8.536-105.663X5*X511660.46662.243X5*X6-7.817-244.629回归结果 根据回归结果得出的二次回归方程为：Y=7.25+0.405X2*X2-8.536X3*X3+11660.466X5*X5-7.817X5*X6，该方程的相关系数为R=1.000，F值=22745.972，显著水平P=0.005，说明该方程的拟合程度较好。 根据回归

9、分析的结果，进行优化后发酵培养基的验证试验，结果见表摇瓶序号12345平均L-Thr产量（g/L）9.879.939.859.849.909.878三、研究结果 1.根据伯杰氏菌种鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册，对L-苏氨酸产生菌WS4006-7E进行形态学鉴定、生理生化鉴定的主要结果为：革兰氏阳性，无芽孢的棒状杆菌，有运动性，氧化发酵产酸不产气，接触酶、甲基红、硝酸盐还原、脂酶阳性，氧化酶、V-P、明胶液化、脲酶等阴性。根据此结果，还不能不能准确确定出WS4006-7E的分类，所以，又对该菌进行了16SrDNA序列同源性分析，结果表明，WS4006-7E与嗜麦芽寡养单包菌的亲缘关系较近，但由

10、于未在同一个最小分支中，所以很难将其定为嗜麦芽寡养单胞菌，所以鉴定结果为该菌为和嗜麦芽寡养单胞菌亲缘关系非常近的一种新菌种。 2.以WS4006-7E为出发菌株，经亚硝基胍、紫外线、硫酸二乙酯逐级诱变，最终选育出一株带有带有Met-+Lys-+Ile-遗传标记的L-苏氨酸高产菌WS4006-7E-NUT-21，发酵72h可产L-苏氨酸5.679 g/L。 3. 通过对种子培养基和种子培养条件的优化，确定了最佳种子培养基及种子的最适培养条件。应用单因素试验设计和均匀设计，确定了最适的发酵培养条件，最适的发酵培养基组成及配比。四、展望 1.本文选育得到的L-苏氨酸产生菌WS4006-7E产酸水平较高，但是由于时间有限，还没有使之达到理想的产酸水平，可能是菌种本身的原因，因为经菌种分类鉴定，WS4006-7E为嗜麦芽寡养单胞菌，该菌本身具有分解多种糖类产酸的能力，但其分泌量比