拟南芥蛋白质二硫键异构酶(AtPDI1)活性位点对抗逆功能的影响

1、拟南芥蛋白质二硫键异构酶 （AtPDI1 ）活性位点对抗逆功能的影响蛋白质二硫键异构酶（ protein disulfide isomerase,PDI ）可以催化二硫 键异构化、氧化及还原 , 也往往具有分子伴侣功能。来源于不同动、植物的 PDI 的活性中心都有 2 对保守半胱氨酸（ Cys）, 突变后造成催化活性丧失 , 但不影响 PDI 的分子伴侣功能。前期研究表明体外重组表达的拟南芥 AtPDI1 具有二硫键异构酶活性 , 且能 提高大肠杆菌细胞的抗逆能力。为了探究 AtPDI1 在植物体内是否有抗逆功能且 是否与其二硫键异构酶活性有关 , 本研究将编码 AtPDI1 活性位点的 Cy

2、s 序列进行 了突变,并回补拟南芥AtPDII缺失突变体（pdi ）,研究不同株系对非生物胁迫的 响应, 主要研究结果如下 : （1）突变 AtPDI1 活性中心半胱氨酸位点的编码序列 , 构建表达载体并转化拟南芥 pdi, 获得 T3 代纯合转基因植株。将编码 AtPDII 活性位点的 Cys（Cys128/Cys131、Cys467/Cys470）的密码 子进行突变,得到两个突变体 AtPDII,即PDI1<sub>C128AC131A</sub和 PDI1_C467AC470AB PDI1<sub>m1</s

3、ub：和 PDI1<sub>m2v/sub表示。 将之前构建的野生型 AtPDII 及 PDI1<sub>m1v/sub和 PDI1_m2$化拟 南芥pdi,通过抗生素筛选、外源基因 PCF鉴定,在T₃代获得纯合的 转基因株系，分别表示为 pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1_m2 和 pdi-PDI1 。（2）AtPDI1 活性半胱氨酸位点突变影响了种子萌发阶段对胁迫的耐受性。对上述3个株

4、系及野生型拟南芥（WJ、AtPDI1超表达株系（WT-PDI1及pdi进行不同的处理 , 在非胁迫培养下 , 不同株系的萌发率及萌发速度基本一致 , 但胁迫培养下（培养基分别含有 NaC、甘露醇、H<sub>2v/sub>O<sub>2v/sub：和ABA , 各株系的萌发差异明显 ,pdi-PDI1_m1 和 pdi-PDI1_m2 的 萌发率明显低于pdi-PDI1,pdi-PDI1的萌发率与WT相似，但低于超表达株系WT-PDI1;胁迫条件下根长的差异与萌发率有相似的趋势

5、。（3）AtPDI1 活性半胱氨酸位点突变也影响了幼苗对胁迫的耐受性。对苗期 的不同 AtPDI1 株系进行胁迫处理 , 结果表明盐胁迫、 渗透胁迫、 低温和高温处理 后,pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1_m2 和 pdi 突变体均表现出较 低的胁迫耐受性,与WT pdi-PDI1和WT-PDI1相比,生长缓慢,存活率较低;WT-PDI1抗性最强,pdi-PDI1与WT较为接近,说明野生型PDI1可以回补pdi 功能的缺失,而保守半胱氨酸突变之后则不能回补 pdi 功能的缺失,表型与 pdi 相似,

6、 抗逆能力降低。（4）AtPDII抗逆功能与ABA信号途径有关。利用qRT-PCF技术对ABA合成 有关的基因（NCED3 ABA1 ABA2的表达量进行检测，发现盐胁迫下 pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1_m2 与 pdi 突变体的上调倍数差异 不大，但明显低于pdi-PDI1、WT和WT-PDI1;盐胁迫也影响了 ABA1号转导途径 相关基因（RD29A KIN1、Ann At）的表达,不同株系变化趋势的差异与 ABA合成 有关的基因类似。说明AtPDI1提高植物的抗逆能力与ABA合成和其信号途

7、径有关,且保守Cys 对AtPDI1功能的发挥起重要作用。（5）AtPDI1活性位点突变影响了植物体内 ROS 清除能力。对盐和渗透胁迫处理后的ROS积累量进行了 NBT染色检测,pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1_m2 与 pdi 的染色程度最深, 说明其RO驭累多;pdi-PDI1与WT勺染色次之,但重于WT-PDI1的染色。各株系 活性氧清除相关基因SOD POD CAT和APX的表达与ROS勺积累相反，WT-PDI1 表达量上调倍数最多，而 pdi-PDI1_m1、pdi-PDI1<sub&g