生物技术育种

1、利用小孢子培养为技术核心的十字花科蔬菜优异材料创新 1项目的立项依据1.1 项目的意义众所周知：北方的大白菜、南方的青菜、全国的甘蓝和萝卜、出口的青花菜、我省的花椰菜、榨菜、雪菜等十字花科蔬菜，在农业生产中、在种植业结构调整中、在人们日常生活中、在增加农民收入中有着举足轻重的地位；尤其在世界经济一体化趋势的今天，这些十字花科蔬菜更凸现了我国之可贵的传统特色。在我国社会快速发展的今天，行业人士无不深感：进入新世纪，我国蔬菜新品种数量虽呈对数式增加，而具市场潜力和应用前景的突破性品种却凤毛麟角，目前主要蔬菜商业品种的遗传相似性越来越高，在兵临城下的国际竞争面前我国蔬菜种业呈严峻形势，这给我国蔬菜育

2、种提出了“快速、突破、创新”之要求，而实现新品种突破的关键在于优异材料的创新。近年来快速发展起来的十字花科蔬菜游离小孢子培养技术与传统育种技术的结合是优异材料快速创新的有途径之一，它只需12年即可纯化远缘杂交产生的特异种质资源、纯化国内外引进的优良育种材料、纯化优良性状聚合后的种质，而有效获得大量不同性状的DH纯系，通过鉴定与筛选进而得到优异的材料，用于培育新品种，对由多基因控制的特异性状的筛选也能实现一步到位。迄今，本课题组拥有大白菜、青菜、甘蓝、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等十字花科蔬菜种质1500余份；在其远缘杂交、国内外优良品种的分离、多个优良性状的聚合等方面做了大量的工作；在其游离小孢

3、子培养方面投入了大量精力，其技术基本成熟，现已成功培育出一些大白菜、甘蓝、青花菜、花椰菜的DH系，其中部分优异的DH系已应用于新品种的选育之中。该项目的实施将为我省十字花科蔬菜种质资源的挖掘、育种技术的提升和材料创新等方面做出有益的探索；将为十字花科蔬菜新品种的选育打下良好的基础；将为我国十字花科蔬菜优异材料的创新和新品种的选育走上“突破”“创新”“快速”发展轨道做出大的贡献；对填补我国十字花科蔬菜优异材料短缺、提升我省蔬菜育种技术水平、提高我省蔬菜育种地位、拉动我省种籽行业的知名度和竞争力、促进我省蔬菜产业的发展、增加农民收入、推动我省农业的快速发展以及我省自主知识产权走出国门等方面都具重要

4、意义。1.2 国内外研究进展研究现状优异材料是构成优异品种的基础，优异材料的创新一直被国内外育种工作者高度重视。1982年，Lichter首次报道甘蓝型油菜小孢子培养形成植株。随后，这一技术不断加以改进。加拿大、英国、德国、日本均有报道，其中以加拿大所做工作最多，成果最为突出。到目前为止，我国已经利用小孢子培养技术得到了大量的油菜小孢子植株，在大白菜中利用小孢子培养技术获得了大批纯合自交不亲和系。此外，游离小孢子培养技术在小白菜、甘蓝、花椰菜、红菜薹、青花菜等十字花科蔬菜方面也有报道。（1）利用小孢子培养育成的十字花科蔬菜新材料及新品种目前，游离小孢子培养技术正在十字花科作物育种中发挥着重大作

5、用。1998年河南农科院已经利用游离小孢子培养技术先后育成豫白菜7号、豫园50等多个大白菜新品种。1998年华中农业大学陈玉萍等借鉴大白菜小孢子的培养获得单倍体、再经加倍获得二倍体纯系的方法，进行了包心芥菜品种游离小孢子技术的研究。1999年北京市蔬菜研究中心利用小孢子培养技术育成了优质大白菜新品种桔红心1号，而且还利用大白菜的小孢子胚状体获得了抗除草剂转基因植株。2005年北京市农林科学院蔬菜研究中心利用游离小孢子培养结合苗期人工接种抗病性鉴定技术育成中熟青麻叶类型京翠70号大白菜一代杂种。天津的科研单位也正在利用小孢子技术进行自交系的纯化工作。（2） 利用远缘杂交、小孢子培养进行十字花科蔬

6、菜新种质创新2006年福州市蔬菜研究所陈文辉等进行了甘蓝和青花菜杂种小孢子培养研究。（3）利用小孢子培养筛选十字花科蔬菜各种抗性的突变体利用培养物的突变能够产生抗病、抗盐、抗除草剂的高产植株。Ahmad L等用UV紫外线处理大白菜分离小孢子获得抗根腐病突变体。2005年北京市农林科学院曹鸣庆等曾将大白菜黑斑病毒素加入培养基，结果从诱导得到的小孢子胚中筛选出了对黑斑病表现一定程度抗性的大白菜小孢子植株。发展趋势虽然小孢子培养技术在育种工作和基础研究中有了很多应用，对作物改良和种质创新具有十分重要的地位和意义，并随着小孢子培养技术及其各种育种方法的日益成熟，越来越被众多跨国种子公司和育种工作者作为

7、实用生物技术所接纳并采用。但是，小孢子培养技术有一些机制还不清楚。诱导频率不高、物种及基因型间存在差异，是目前实际应用中的一大障碍。小孢子培养的启动仅是在猜测、探讨中。今后发展的趋势：在逐渐实现小孢子培养技术实用化的过程中，深入研究小孢子胚胎发生机制、激发机制、自然加倍机制以及与之相对应的生理生化、遗传因素；将小孢子培养技术与传统育种技术、转基因技术、分子标记技术相结合。1.3主要参考文献许勇,丁海凤. 蔬菜优异种质挖掘与创新是推动我国蔬菜种业进步的有效途径. 中国蔬菜,2005（7）:18-21葛亚明, 陈利萍. 植物细胞工程在十字花科作物种质创新中的研究进展. 细胞生物学杂志, 2004,

8、26:471-474顾宏辉, 胡林军, 周伟军. 小孢子培养技术在芸苔属作物育种上的应用研究进展. 农业生物技术学报, 2004,12 (2): 219-223轩正英. 芸薹属蔬菜游离小孢子培养技术研究进展. 塔里木大学学报, 2006, 18（3）：46-50韩阳,许艳辉,冯辉. 白菜游离小孢子培养研究进展.沈阳农业大学学报, 2002，33( 3)：228 231汤青林,宋明,张钟灵.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究进展.西南农业学报,2000,13（3）：98-103姜凤英,冯辉,李娜,王平.甘蓝类植物游离小孢子培养研究进展.辽宁农业科学, 2006（5）：28-30郭金英,申书兴,陈雪平等

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11、sica oleracea var. italica L.). Journal of Experimental Botany 49. 1998, 49: 101-106.Christine Q, Hon g SW, Elizabeth V, et al. Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell, 2000, 12(4): 479492. FAO / IAEA. Mutation Varieties Database. 2007, http:/www-inf

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13、Kordaow J, Czosnowski E, et al. Effect of thermal conditions on the initiation of broccoli curd. Journal of Polish Agricultural Universities, 2002, 5(2): 1-8.Kott LS. Application of doubled haploid technology in breeding of oilseed Brassica napus. AgBiotech News and Information. 1998, 10: 69-74. NAL

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15、hang FL & Takahata Y. Microspore mutagenesis and in vitro selection for resistance to soft rot disease in Chinese cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis). Breeding Science, 1999, 49: 161-166.2 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。2.1研究内容在本课题组现有的较为成熟的十字花科蔬菜游离小孢子培养技术的基础上，有计划、有目标地较大规模地开展其游离小孢子培养，以快速育成多

16、个具有自主知识产权和育其种应用前景的十字花科蔬菜优异育种材料，实现生物技术的实用化是本项目研究的主要目标；围绕其目标，拟进行以下主要研究内容：（1）聚合杂交、构建核心种质根据青菜（小白菜）、大白菜、包心菜（结球甘蓝）、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等不同十字花科蔬菜目前和长远的育种目标所需，结合多年积累的育种经验，在抗病性、抗逆性、品质、商品性、耐寒性、耐热性、耐抽薹性、适应性等方面进行有目标的聚合杂交，构建核心种质，以此预期培养出符合其不同育种需求的优异育种材料。（2）规模化游离小孢子培养利用本课题组现有的较为成熟的青菜（小白菜）、大白菜、包心菜（结球甘蓝）、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等不同十字

17、花科蔬菜游离小孢子培养技术体系，有规模地进行其游离小孢子培养，预期培养出大量的DH植株。（3）大量DH植株的系统鉴定对培养出的大量DH植株，根据其不同的育种要求，进行其特征特性的系统鉴定，特别是抗病性（多抗）、抗逆性、品质、商品性、耐寒性、耐热性、耐抽薹性、适应性等特异性鉴定。（4）优异材料的评估与筛选在大量DH材料系统鉴定的基础上，根据不同的育种目标，结合生产实际与多年的育种经验（包括配合力测定），对其进行评估与筛选，以获得优异材料。（5）培养技术体系的改良与完善结合项目实施，对上述不同蔬菜的培养技术体系进行改良与完善，特别是榨菜、雪菜及包心菜培养技术体系进行的改良与完善性研究，以提高其培养

18、效率。2.2研究目标升华传统的十字花科蔬菜育种技术；实现生物技术的实用化；在较短的时间内，利用游离小孢子培养技术育成具有自主知识产权和应用前景的十字花科蔬菜优异育种材料。2、具体指标（1）育成优异的十字花科蔬菜育种材料共计30份。其中：青菜（小白菜）4份、大白菜9份、包心菜（结球甘蓝）4份、青花菜3份、花椰菜6份、榨菜2份、雪菜2份。这些材料要求：是DH系，育性正常，在抗病性、抗逆性、商品性、品质、耐寒性、耐热性、耐抽薹性、适应性等方面优异性突出，在育种（或生产上）可迅速利用。（2）形成较为完善的青菜（小白菜）、大白菜、包心菜（结球甘蓝）、青花菜、花椰菜、榨菜、雪菜等7种十字花科蔬菜游离小孢子

19、培养技术的实用化体系。（3）发表游离小孢子培养及其材料创新的相关论文3篇。3、应用或产业化前景开展“以游离小孢子培养为技术核心的十字花科蔬菜优异材料创新”项目研究，对于开发利用符合我省消费习惯的优良的地方品种，对于研发十字花科蔬菜特、异、优、新的种质资源，对于筛选各种抗性突变体育种材料，对于育成符合市场需求的十字花科蔬菜突破性优良新品种，对于促进我省蔬菜产业发展等方面具有广阔的应用和产业化前景。2.3拟解决的关键问题（1）聚合杂交、构建核心种质结合多年积累的育种经验，在抗病性、抗逆性、品质、商品性、耐寒性、耐热性、耐抽薹性、适应性等方面进行有目标的聚合杂交，构建核心种质，以此预期培养出符合其不

20、同育种需求的优异育种材料。（2）规模化游离小孢子培养利用本课题组现有的较为成熟不同十字花科蔬菜游离小孢子培养技术体系，有规模地进行其游离小孢子培养，预期培养出大量的DH植株。（3）大量DH植株的系统鉴定对培养出的大量DH植株进行其特征特性的系统鉴定。（4）优异材料的评估与筛选在大量DH材料系统鉴定的基础上，根据不同的育种目标，结合生产实际与多年的育种经验（包括配合力测定），对其进行评估与筛选，以获得优异材料。（5）培养技术体系的改良与完善结合项目实施，对上述不同蔬菜的培养技术体系进行改良与完善，特别是榨菜、雪菜及包心菜培养技术体系进行的改良与完善性研究，以提高其培养效率。3拟采取的研究方案及可

21、行性分析。本项目以目标种质的广泛搜集与优良性状的聚合为起点，以游离小孢子培养为材料纯化的主要手段，在实现大量DH植株的基础上，结合常规选育与鉴定方法，实现耐抽薹、耐热、抗病、优质等优异目标材料的创新；具体实施将本着充分利用现有资源、充分利用现有技术积累、创新与传统相结合、研究与应用相结合、生物技术与传统技术相结合的原则；采取内容、时间、空间互动的研究策略，确保在较短时间内，完成关键技术研究、优异材料创新等项目任务。技术路线图挖掘各类原始种质的聚合杂交、构建各类核心种质性状鉴定UV诱变技术规模化游离小孢子培养单核靠边期花蕾分离小孢子培养技术的改良与完善高温处理NLN液培（25）再生植株的春化与越

22、夏技术的改良与完善 DH纯系综合评估技术的改良与完善优异突变体的筛选技术的改良与完善固体培养基培养综合性状鉴定技术的改良与完善加倍 DH植株综合性状的系统鉴定DH纯系的综合评估与筛选各种创新性优异育种材料七种蔬菜的游离小孢子培养技术体系4本项目的特色与创新之处4.1项目特色（1）游离小孢子培养高成胚率技术；（2）小孢子抗病、耐盐碱突变体的筛选技术；（3）游离小孢子再生植株的春化、越夏及正常结籽技术；（4）品质、抗热性等综合性状的鉴定技术。4.2项目创新之处本项目以目标种质的广泛搜集与优良性状的聚合为起点，以游离小孢子培养为材料纯化的主要手段，在实现大量DH植株的基础上，结合常规选育与鉴定方法，

23、实现耐抽薹、耐热、抗病、优质等优异目标材料的创新。从种质的收集到鉴定、从目标性状的聚合到小孢子DH系培养、从DH植株的鉴定到优异性综合评估均由项目组科技人员自主完成，项目科研属原始创新。5年度研究计划及预期研究结果项目计划2010年1月至2012年12月实施，其年度计划是：起始年月进 度 目 标2010-01-01至2010-12-311、项目组织实施、工作准备。（细化方案、挖掘种质、改善设备等）2、聚合杂交、构建各类核心培养材料。（鉴定、杂交、培植等）3、游离小孢子培养及诱变。（培养、UV诱变、技术改良与完善等）2011-01-01至2011-12-311、游离小孢子培养。（培养、技术改良与

24、完善等）2、DH材料的鉴定。（特征特性鉴定、育性鉴定等）3、优异育种材料的筛选。（重要优异材料的筛选及繁殖）2012-01-01至2012-12-311、技术关键的攻关，完善培养技术体系。（重点是榨菜、雪菜）2、项目总结、验收。6研究基础与工作条件1、项目申请单位多年一直开展十字花科蔬菜新品种的选育工作，曾承担过浙江省“八五”、“九五”、“十五”大白菜、小白菜、青菜、萝卜等新品种的选育与推广项目。先后选育成一批在生产上有重要栽培价值的十字花科蔬菜新品种，创造了明显的社会经济效益，曾获浙江省科技进步二等奖和国家科技进步三等奖。目前正以抗病、丰产为基础，开展优质型、生态型、加工型、出口型为目标的新

25、品种选育工作。2、项目申请课题组现拥有十字花科蔬菜种质资源1500余份，其中：大白菜800余份、青菜200余份、甘蓝100余份、青花菜100余份、花椰菜200余份、榨菜20余份、雪菜30余份、其它50余份；并在其远缘杂交、国内外优良品种的分离、多个优良性状的聚合等方面做了大量的种质储备工作，这为顺利完成本申请项目提供了良好的物质条件。3、项目申请重点实施的游离小孢子培养，将在依托单位的省蔬菜重点实验室进行，该实验室拥有实施本项目所需的主要仪器设备，包括LI-6400便携式光合仪、FACSCalibur 流式细孢仪、分光光度计、HPLC、无菌过滤器、超净工作台、MQ超纯水装置、制冰机、大容量离心机、人工气候室、光温培养箱、生化培养箱、冰箱冰柜、大功率摇床、大容量灭菌锅、分析天平、倒置显微镜、微机与统计分析软件以及其它常规仪器等；和人工气候箱、恒温组培室、无菌操作室、可控温室、连栋大棚、试验地等配套设