生化实验--质粒DNA提取

1、质粒质粒DNA的小量快的小量快速提取（碱裂解法）速提取（碱裂解法）实验背景实验背景1、质粒是染色体外的、质粒是染色体外的DNA分子，大小为分子，大小为1KB200KB2、大多数来自于细菌的质粒是双链、共价、大多数来自于细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。细菌内的共生型遗传因子。3、其复制和遗传独立于细菌染色体，但复、其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。2、严瑾型质粒：严瑾型质粒的复制需要一、严瑾型质粒：严瑾型质粒的复制需要一个质粒编码的蛋白，质

2、粒的拷贝数不能通个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过氯毒素等蛋白合成抑制剂来增加。过氯毒素等蛋白合成抑制剂来增加。质粒类型质粒类型质粒按复制方式可以分为两种类型：质粒按复制方式可以分为两种类型： 1、松弛型质粒：松弛性质粒的复制不需、松弛型质粒：松弛性质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶，即使蛋白质合成提供的半衰期较长的酶，即使蛋白质合成受到抑制，质粒的复制依旧进行。受到抑制，质粒的复制依旧进行。质粒的应用质粒的应用1、大多数基因工程使用的是松弛型质粒、大多数基因工程使用的是松弛型质粒2、严瑾型质粒用来表达一些可使宿主细胞

3、、严瑾型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。受毒害致死的基因。3、质粒的特点使质粒成为外源基因进入细、质粒的特点使质粒成为外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因工具在基因过程中具有极其广泛的应用价工具在基因过程中具有极其广泛的应用价值。值。质粒的性质中与载体作用关系密切的包括：质粒的性质中与载体作用关系密切的包括： 1、质粒的复制型、质粒的复制型 2、质粒的不相容性、质粒的不相容性 3、质粒的接合性、质粒的接合性 4、多克隆位点多克隆位点 5、筛选标记、筛选标记 1、质粒能在细菌中垂直遗传，并且赋予、质粒能在细菌中垂直遗传，并且赋予宿主

4、细胞一些表型，是比病毒更简单的原宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。始生命。质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，1952年由年由Lederburg正式命名为质粒。正式命名为质粒。质粒特点质粒特点质粒对细菌本身的生长繁殖不是必需的，质粒对细菌本身的生长繁殖不是必需的，但可以赋予细菌一定的表型，如抗药性等。但可以赋予细菌一定的表型，如抗药性等。 它是基因操作工程中常用工具中载体的一它是基因操作工程中常用工具中载体的一种。是携带目的种。是携带目的DNA片段进入受体细胞进片段进入受体细胞进行

5、扩增和表达的工具。行扩增和表达的工具。 人工基因工程获得胰岛素人工基因工程获得胰岛素 首先获得胰岛素基因，再将胰岛素基因转首先获得胰岛素基因，再将胰岛素基因转入大肠杆菌内，再创造大肠杆菌增殖的有利环入大肠杆菌内，再创造大肠杆菌增殖的有利环境，对大肠杆菌进行大规模培养，使之产生大境，对大肠杆菌进行大规模培养，使之产生大量的治疗糖尿病的药物量的治疗糖尿病的药物-胰岛素，提取纯化。胰岛素，提取纯化。分离质粒分离质粒DNA的方法的方法从大肠杆菌中分离质粒从大肠杆菌中分离质粒DNA的方法众多，的方法众多，目前常用的有目前常用的有:1、碱裂解法、碱裂解法2、煮沸法、煮沸法3、SDS法法4、羟基磷灰石层析法

6、、羟基磷灰石层析法这几种方法概括起来说主要采用非这几种方法概括起来说主要采用非离子型或离子型去污剂，有机溶剂离子型或离子型去污剂，有机溶剂或碱进行处理及加热处理或碱进行处理及加热处理所有分离质粒所有分离质粒DNA的方法都包括三的方法都包括三个基本步骤：个基本步骤：培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌收集和裂解细菌；分离质粒分离质粒DNA选择哪一种方法取决于以下几个选择哪一种方法取决于以下几个因素：因素： 1、质粒的大小、质粒的大小 2、大肠杆菌菌株、大肠杆菌菌株 3、裂解后用于纯化的技术和、裂解后用于纯化的技术和实验要求实验要求各种方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大各种方法

7、分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构结构等特点加以选择的，其小、碱基组成及结构结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且回收效率高，提取的质粒中碱变性法既经济且回收效率高，提取的质粒DNA可用于酶切，连接和转化。可用于酶切，连接和转化。质粒质粒DNADNA的提取的提取实验目的实验目的 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。作用。 质粒质粒 (plasmid) 共价、闭合、环状的小分子量共价、闭合、环状的小分子量DNA； 能在宿主细胞内独立自主复制；能在宿主细胞内独立自主复制； 带有某些遗传信息带有某些遗传信息, , 会

8、赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 实验原理实验原理 质粒的复制类型质粒的复制类型 严瑾型严瑾型: 只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1-2个质粒。个质粒。 松弛型松弛型: 质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制停止后，质粒仍然能继续复制，每个细胞中含有停止后，质粒仍然能继续复制，每个细胞中含有10-200个拷贝。个拷贝。 载体载体(Vector)能自主复制；能自主复制；有克隆位点有克

9、隆位点(外源外源DNA插入点插入点)，常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；，常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA. . 质粒提纯思路质粒提纯思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白质、基因组要去除的物质：蛋白质、基因组DNA、RNA 碱裂解法碱裂解法 碱裂解抽提质粒碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体是基于染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的差异而的变性与复性的差异而

10、达到分离目的。达到分离目的。实验原理分析实验原理分析 碱性碱性 条件条件 变性变性 质粒质粒DNA染色体染色体DNA碱裂解法碱裂解法 在在pH值高达值高达12.6的碱性条件下，的碱性条件下，染色体染色体DNA的氢键断裂，的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的的大部分氢键大部分氢键也断裂，但也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以当以pH4.8的的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变值至中性时，变性的质粒性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体又恢复原来

11、的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋白质、蛋白质SDS复合物等一起沉复合物等一起沉淀下来而被除去。淀下来而被除去。1.手工碱裂解法抽提质粒5 M KAC 酸性条件下质粒酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白复性，变性蛋白-SDS和和染色体染色体DNA沉淀沉淀50 mM葡萄糖葡萄糖, TrisHCl (25mM, pH8.0), 10 mM EDTA 分散细胞，鳌合金属离子使分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活金属酶失活0.2 M NaOH, 1% SDS 碱性水

12、解细胞壁肽聚糖，碱性水解细胞壁肽聚糖，核酸和蛋白质变性核酸和蛋白质变性无水乙醇无水乙醇: 除去除去DNA水化层，沉淀水化层，沉淀DNATE (Tris + EDTA)缓冲液缓冲液: 溶解溶解DNA平衡酚平衡酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇 = 25:24:1 氯仿使蛋白质变性并分离水相与有机相。平衡氯仿使蛋白质变性并分离水相与有机相。平衡酚使酚使DNA在上清中在上清中(pH=7.8, 酸性下酸性下DNA位于有机位于有机相，酚的密度大相，酚的密度大)。异戊醇可消除出现的泡沫。异戊醇可消除出现的泡沫。对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解细菌裂解细菌离心取上

13、清离心取上清 (含质粒含质粒DNA)柱吸附柱吸附(预处理柱预处理柱)PW漂洗漂洗PD洗涤洗涤去蛋白去蛋白EB溶解溶解DNA质粒质粒DNA溶液溶液2.2.质粒提取试剂盒质粒提取试剂盒( (离心柱型离心柱型) )最后低盐，高最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜上洗脱从硅胶膜上洗脱。实验器材和试剂实验器材 超净工作台、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、1.5mL离心管、加样枪、离心吸附柱、废液收集管试剂1.含有质粒含有质粒pCDA3.1的大肠杆菌的大肠杆菌DH5a 2. LB液体培养基液体培养基3. 平衡液平衡液BL4. STE缓冲液缓冲液(溶液溶液P1)5

14、. 裂解液裂解液 (溶液溶液P2)6. NaAc溶液溶液 (3M, pH 4.8) (溶液溶液P3)7.去蛋白液去蛋白液PD8.漂洗液漂洗液PW 9.洗脱缓冲液洗脱缓冲液EB10. RNaseA (10 mg/mL) 溶液溶液1：悬浮细胞，抑制：悬浮细胞，抑制DNASE溶液溶液1: 50mM葡萄糖葡萄糖 25mM Tris-HCL(PH=8.0) 10mM EDTA(PH=8.0) 葡萄糖：增加溶液的粘度，悬浮菌体，葡萄糖：增加溶液的粘度，悬浮菌体，避免快速沉淀，维持渗透压，防止避免快速沉淀，维持渗透压，防止DNA受机械作用力而降解。受机械作用力而降解。EDTA:金属螯合剂，螯合金属螯合剂，螯

15、合Mg2+、Ca2+等等二价金属离子，抑制二价金属离子，抑制Dnase对对DNA的降的降解作用解作用Dnase:脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶 它发挥它发挥作用时需要金属离子做辅基作用时需要金属离子做辅基溶液溶液2：裂解细菌，变性：裂解细菌，变性DNA和少量蛋白和少量蛋白质质溶液溶液2（新鲜新鲜配制）：配制）：0.2M NaOH 1% SDSNaOH:破解细胞（瞬间溶解细胞膜，细胞膜破解细胞（瞬间溶解细胞膜，细胞膜发生从双层膜结构到微囊结构的变化），发生从双层膜结构到微囊结构的变化），释放释放DNA，使蛋白质变性。，使蛋白质变性。DNA在在5PH9的溶液中是稳定的，但当的溶液中是稳定的，但当PH

16、12时，时，就会引起双链之间的氢键解离而变性。溶就会引起双链之间的氢键解离而变性。溶液液2中的中的NaOH的浓度为的浓度为0.2M，加到提取液，加到提取液中时，该系统的中时，该系统的PH12，因而促使染色体，因而促使染色体DNA和质粒和质粒DNA的变性。的变性。为什么要新鲜配制？为什么要新鲜配制？为什么采为什么采用用NaOH?SDS：是一种离子型表面活性剂，其主要功能是：是一种离子型表面活性剂，其主要功能是溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，因而溶解膜蛋白，溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，因而溶解膜蛋白，破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋能与蛋白质结合，使蛋白质变

17、性而沉淀下来，白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来，为后续处为后续处理需要。理需要。注意：注意：1、处理时间不能过长处理时间不能过长；否则碱性条件下基因组；否则碱性条件下基因组DNA会慢慢断裂会慢慢断裂2、温柔混合温柔混合；避免机械剪切导致已经变性的基；避免机械剪切导致已经变性的基因组因组DNA断裂断裂SDS:十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠溶液溶液3：是大部分蛋白质和细菌基因：是大部分蛋白质和细菌基因组组DNA沉淀沉淀溶液溶液3（PH=4.8）：）：0.5M 60ml KAC 11.5ml冰醋酸冰醋酸 28.5ml 水水本质上是本质上是KAC-HAC的缓冲液；用的缓冲液；用PH=4.8的的溶液溶液3

18、是为了把强碱性的提取液调回至是为了把强碱性的提取液调回至PH中中性，使变性的质粒性，使变性的质粒DNA能够复性并稳定存能够复性并稳定存在在KAC：SDS能与蛋白质结合，能与蛋白质结合，SDS能与能与KAC生产生产PDS，PDS的溶解度要比的溶解度要比SDS低得多，从而使大部低得多，从而使大部分的蛋白质与细菌基因组分的蛋白质与细菌基因组DNA一起沉淀一起沉淀，使沉使沉淀淀更完更完全全。另外可以中和核酸上的电荷，减小相斥。另外可以中和核酸上的电荷，减小相斥力，有利于变性的大分子染色体力，有利于变性的大分子染色体DNA、RNA互相互相聚合而沉淀下来。聚合而沉淀下来。为何加入溶液为何加入溶液3之后出现

19、之后出现大量的沉淀？这沉淀的大量的沉淀？这沉淀的本质是什么？本质是什么？这里还需把SDS除掉的原因是？酚酚/氯仿氯仿/（异丙醇）：抽提去除蛋白（异丙醇）：抽提去除蛋白酚：使蛋白质变性酚：使蛋白质变性氯仿：水饱和酚比重略比水重，遇到高浓度盐，氯仿：水饱和酚比重略比水重，遇到高浓度盐，离心后酚想转移至上层，不利于含质粒水相的离心后酚想转移至上层，不利于含质粒水相的回收，加入氯仿可增重其比重，使酚回收，加入氯仿可增重其比重，使酚-氯仿始终氯仿始终在下层，另外避免酚进入水相。在下层，另外避免酚进入水相。异丙醇：让离心后上下层的界面更清晰，方便异丙醇：让离心后上下层的界面更清晰，方便水相的回收水相的回收

20、为何不加氯仿，酚会为何不加氯仿，酚会大量进入水相？大量进入水相？无水乙醇：沉淀质粒无水乙醇：沉淀质粒DNA乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇和核乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇和核酸不会起任何化学反应，对酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，很安全，因此是理想的因此是理想的DNA沉淀剂沉淀剂DNA溶液中溶液中DNA是以水和状态稳定存在的，是以水和状态稳定存在的，当加入乙醇的时候，乙醇会夺取当加入乙醇的时候，乙醇会夺取DNA周围周围的水分子，使的水分子，使DNA失水而易于聚合失水而易于聚合RNaseA：使：使RNA降解，减少提取得到的降解，减少提取得到的质粒质粒DNA中的中的RNA，以便减少对后续

21、实验，以便减少对后续实验的影响。的影响。为何要用无水乙醇为何要用无水乙醇,加入两倍体积无水乙醇后，乙加入两倍体积无水乙醇后，乙醇含量就变为了醇含量就变为了67%, ，用，用95%的乙醇可不可以，的乙醇可不可以，无水乙醇的价格要比无水乙醇的价格要比95%的乙醇价格要贵得多的乙醇价格要贵得多实验步骤实验步骤1、 细菌培养：细菌培养： 将含有将含有pQE30质粒的大肠埃希菌质粒的大肠埃希菌接种到接种到TG1 10 uL接种到接种到10ml含氨苄西林含氨苄西林(100 g /mL)的的LB培养液中，培养液中， 37摇培过夜摇培过夜(10-12h).2、收集菌体收集菌体：取取1.5 mL菌液转入离心管中

22、菌液转入离心管中 10000 rpm，1min弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清3. 悬浮细菌：悬浮细菌： 将细菌沉淀重悬于将细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液用冰预冷的溶液p1中，涡旋震荡，彻底悬浮细菌沉淀。中，涡旋震荡，彻底悬浮细菌沉淀。注意：细胞悬液必须悬浮均匀，无可见沉淀块，否则所提质粒注意：细胞悬液必须悬浮均匀，无可见沉淀块，否则所提质粒DNA的纯度及所得的纯度及所得率会大大降低。率会大大降低。4. 碱液裂解细菌：碱液裂解细菌：加加200 uL新配制的新配制的溶液溶液P2，立即轻柔颠倒离心管，立即轻柔颠倒离心管6-8次。使管内

23、内容物混匀，禁次。使管内内容物混匀，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置止剧烈振荡。置冰浴中放置2min。5. 中和与复性：中和与复性： 加加150 uL用冰预冷的用冰预冷的溶液溶液P3，立即温和颠倒离心管数，立即温和颠倒离心管数次。，使溶液次。，使溶液p3在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中置冰浴中5min6.离心沉淀：离心沉淀： 12000 rpm, 5min将含质粒将含质粒DNA的上清转移到另一离心管中的上清转移到另一离心管中 7. 去蛋白：去蛋白：加等体积酚加等体积酚-氯仿，剧烈振荡混匀，静置氯仿，剧烈振荡混匀，静置3min待其分层后，待其分层后， 120

24、00 rpm, 10 min，将上层液体转入到另外一离心管中，将上层液体转入到另外一离心管中8、 乙醇沉淀质粒乙醇沉淀质粒DNA：加入加入2倍体积倍体积的无水乙醇，震荡混合，静置的无水乙醇，震荡混合，静置5min使质粒使质粒DNA形成沉淀。形成沉淀。 12000rpm, 10 min, 收集质粒收集质粒DNA沉淀，沉淀，弃上清液弃上清液为何要为何要2倍体积的无水乙醇倍体积的无水乙醇9.乙醇洗盐乙醇洗盐: 质粒质粒DNA沉淀里有一定量的盐分需要除去。加入沉淀里有一定量的盐分需要除去。加入1ml 70%乙醇，轻缓摇动数次，乙醇，轻缓摇动数次， 12000rpm, 2 min, 弃上清液弃上清液10

25、.溶解质粒溶解质粒DNA： 待残余乙醇挥发干净后，加待残余乙醇挥发干净后，加30 ul TE缓冲液缓冲液(PH 8.0）溶解沉淀，加溶解沉淀，加2 ul RaseA(10 mg/ml),37度保温度保温30min以去除以去除RNA。所得质粒粒。所得质粒粒DNA置置-20度保存备用。度保存备用。实验是不是还有缺陷，其中实验是不是还有缺陷，其中RNseA怎么除掉怎么除掉为何要加为何要加TE缓冲液，缓冲液，有什么好有什么好处？处？ DNA的保存的保存 1、短期贮存：、短期贮存：4或或-20存放于存放于TE缓冲液中。缓冲液中。TE缓冲液的缓冲液的pH与与DNA贮存有贮存有关，关，pH=8, 可减少可减

26、少DNA脱氨反应，脱氨反应，pH7.0, DNA容易变性。容易变性。2、长期贮存：、长期贮存：-70存置于存置于TE缓冲液中缓冲液中, 在在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。细菌和核酸的污染。注意注意: 小心操作移液器，特别是在加入溶液小心操作移液器，特别是在加入溶液II 和和III后，一定不要剧后，一定不要剧烈振荡，以免切碎烈振荡，以免切碎DNA (包括质粒包括质粒DNA和基因组和基因组DNA)!注意事项注意事项1、在碱液裂解的那个步骤中需轻柔混合，、在碱液裂解的那个步骤中需轻柔混合，不要剧烈振荡，以免打乱基因组不要剧烈振荡，以免打乱基因组DNA，造，造成提取的质粒中混有基因组片段。此时菌成提取