质粒DNA的小量快速提取

1、质粒DNA的小量快速提取 第四组：习文，石子涛，蒋勇，盛世豪 质粒DNA提取是基因克隆中的常规工作，他包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒DNA的抽提过程。实验目的掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。实验原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的

2、NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。碱裂解法基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续

3、稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。质粒检测 琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这

4、三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有710条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。质粒DNA的提取方法1.碱裂解法2.煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4下12000g离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液

5、中, 涡旋混匀。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。 5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4下12000g离心10分钟。 7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8、取20ml进行电泳检查。3.酚氯仿裂解法 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中（含有卡那霉素30 g/mL）摇菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 L TE，充分混匀；加入400 L酚氯仿（11体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀；12 000 g/min离心5 mi

6、n，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0.22 m针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s，12 000 g/min离心5 min；沉淀溶于20 L的RTE溶液中，37水浴. 按PstI内切酶说明书进行酶切反应（37，1 h）. 酶切产物10 L，10 g/L琼脂糖凝胶电泳. PCR引物根据参考文献1设计，预计扩增产物片断大小为714 bp. 常规制备感受态菌E.coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素（30 /mL）LB培养平板中，37培养，15 h后观察筛选克隆情况. 4.碱变性法5.SDS法6. 羟基磷灰石

7、层析法1.器材 高压灭菌器，恒温摇床，高速离心机，微量可调式移液器， 1.5mL离心管等。2.试剂 1、 LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，去离子水950mL，待溶质完全溶解后，用NaOH调pH至7.0，加去离子水至总体积1000mL，121，1.01105Pa高压下蒸气灭菌20分钟。 2.氨苄西林： 100mg/mL 实验试剂和器材 3. 溶液：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH 8.0）。 配制方法：1M Tris-HCl(pH

8、8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121高压灭菌15min ，贮存于4。 4. 溶液（新鲜配置）：0.2M NaOH，1% SDS。 配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 5. 溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。 配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存备用。 6. 酚/氯仿 ：将酚和氯仿等体积混合，用Tris-HCl平衡至pH7.6，至棕色瓶中4。 7. TE缓冲液pH(8.0)：10mM Tr

9、is-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。 8.RNase A(10mg/mL) 9.70%乙醇,无水乙醇。实验步骤 1.细菌培养 将含有pQE30质粒的大肠埃希菌TG1接种到10mL含有氨苄西林（100g/mL）的LB培养液中，37振摇过夜。 2.收集菌体 取1.5ml菌液转入离心管中，10 000r/min离心1min，弃 上清。 3.悬浮细菌 将细菌沉淀重悬于100l用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡使细菌沉淀悬浮。注意：细胞悬液必须悬浮均匀，无可见沉淀块，否则提取DNA的纯度和得率会大大降低。（溶液I的作用是分散细胞，并螯合金属离子使能够破坏质粒DNA的DNase失活。

10、 4.碱液裂解 加入新配制的溶液200l，轻缓颠倒离心管6-8次，使管内容物混均，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置2 min。（溶液的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白质在碱性条件下变性。） 5.中和与复性 加入150l用冰预冷的溶液，轻缓颠倒数次，使溶液III在粘稠的菌液裂解物中分散均匀，在冰浴中放置5min。（溶液的作用是使pH恢复中性，质粒DNA复性，而染色体DNA和蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。） 6.离心沉淀 用台式高速离心机12000r/min 离心5min,将含有质粒DNA的上清转入另一离心管中。 7.酚/氯仿抽提除蛋白 加入等体积的酚-氯仿，剧烈振荡混匀,静置3min待其分层后， 12000r/min离心10min，将上层液转入另一离心管中。 8.乙醇沉淀质粒DNA 加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀，静置5min使质粒DNA形成沉淀。12000r/min离心10min，收集质粒DNA沉淀，弃上清液。 9.乙醇洗盐 质粒DNA沉淀里含有一定量的盐分需出去。加入1ml 70乙醇，轻缓摇动数次，12000r/min离心2 min。弃上清液。 10.溶解质粒DNA 待残存乙醇挥发干净后，加30l TE缓冲液(pH8.0）溶解沉淀，加2l RnaseA（10mg/L)，37保温30min以去除RNA。所得质粒DNA置-20保存备用。注意事项1. 提取过程应尽量保持