第三部分基因组和DNA测序原理

1、基因组测序基因组测序23 chromosomes3,2 x109 base pairs (3,200,000,000) 5% mRNA (30,000 genes) 90% unknown function.random shotgun(HUGO)whole genome shotgun(Celera)whole genome: 3,200,000 kbpartially digested DNA: sizing: 100 - 500 kbBAC librariespieces: 100-500 kbgenesgenesmapped BAC clone: 100-500 kbsheared D

2、NA: 1.0-2.0 kbsequencingtemplates: randomreads (0.6-1 kb)whole genome: 3,200,000 kbsheared DNA: 1.0-2.0 kbsequencingtemplates randomreads (0.6-1 kb)(sequence)gap low base qualitysinglestrandedregionmis-assembly(inverted)1953 DNA fragments having a difference of one nucleotide can be separated on gel

3、 electrophoresisBut these bands cant tell usthe identity of the terminal nucleotidesIf those band with the sameterminal nucleotide can begrouped, then it is possible to read the whole sequence生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。或者多种

4、残基上。由于由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡因此上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位全片段上的位置所决定。置所决定。 在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从

5、凝胶的放射自影片上直接读出的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。上的核苷酸顺序。化学法化学法: 化学裂解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法法)酶法酶法: DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (sanger法法)Sangers Method:Maxam-Gilberts Method:32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATATCGTAGCTAGCTATAGCTAGCTATAGCTAGCTAATCGA32PSpecific Reaction to G ATCGSTOPATerminatedKeep on goingBiosynthetic method

6、Chemical methodTemplateorNon-radioactive(invisible)32PA,T,C,GAAnalogueDestroy CleavageDestroy CleavageATCGATCGATProducing various fragments 基本原理：基本原理： 基于某些化学试剂可以使基于某些化学试剂可以使DNA链在链在1种或种或2种碱基种碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的不同位

7、点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记分析前，用同位素标记DNA的的5 末端，用末端，用4组不组不同的特异反应，就可以使末端标记的同的特异反应，就可以使末端标记的DNA分子切分子切成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 反应的关键反应的关键:使使DNA的的4种核苷酸中，只有种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的种发生特异性的化学切割反应化学切割反应;碱基的特异性修饰碱基的特异性修饰;被修饰的碱基从核糖

8、环上转移被修饰的碱基从核糖环上转移;失去碱基的糖环部位发生失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。链断裂。常用的专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷常用的专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯,甲酸甲酸和肼。和肼。 4 4组特异的反应如下：组特异的反应如下：(1) G(1) G反应反应 用硫酸二甲酯使用硫酸二甲酯使鸟嘌呤鸟嘌呤上的上的N N7 7原子原子甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，多核苷酸甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在该处断裂。链可在该处断裂。(2) G+A(2) G+A反应反应 用甲酸使用甲酸使A A和和G G嘌呤

9、环嘌呤环上的上的N N原子质原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂。键断裂。(3) T+C(3) T+C反应反应 用肼使用肼使T T和和C C的的嘧啶环嘧啶环断裂，再用断裂，再用哌啶除去碱基。哌啶除去碱基。(4) C(4) C反应反应 当有盐存在时，只有当有盐存在时，只有C C与肼反应，并与肼反应，并被哌啶除去。哌啶促使修饰碱基脱落，并使去掉被哌啶除去。哌啶促使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂。碱基的磷酸二酯键断裂。 Maxam-Gilbert化学降解测序法化学降解测序法先用限制性内切酶把先用限制性内切酶把DNA切切成成102

10、00bp 的测序材料，的测序材料，用碱性磷酸化酶处理该片段，用碱性磷酸化酶处理该片段，消除消除5末端上的磷酸，末端上的磷酸，在在5OH端标记端标记32P，用多，用多 核核苷酸磷酸激酶催化，苷酸磷酸激酶催化，标记片段变性为单链，标记片段变性为单链，化学试剂在特定碱基位置降化学试剂在特定碱基位置降解单链解单链DNA， 产生一组长度产生一组长度不等的不等的DNA片段，片段， 反应试剂反应试剂G反应：硫酸二甲酯反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸反应：甲酸T+C反应：肼反应：肼C反应：反应：NaCl+肼肼化学试剂在特定碱基位置化学试剂在特定碱基位置降解单链降解单链DNA， 产生一组产生一组长度不等的长度不

11、等的DNA片段，片段，经电泳和放射性自显影后，经电泳和放射性自显影后，从从4个反应系统统一阅读，个反应系统统一阅读， 待测待测DNA的全部核苷酸序的全部核苷酸序列就可直接读出。列就可直接读出。 Maxam-Gilbert 化学降解测序法不需要进行酶催化反应，化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的对未经克隆的 DNA 片段可以直接测序；片段可以直接测序；化学降解测序法特别适用于测定含有如化学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤 A 或者或者 G ， C 含量较高的含量较高的 DNA 片段

12、，以及短链的寡核苷片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。酸片段的序列。 测定的长度短测定的长度短(如裂解位点的统计学分布等等如裂解位点的统计学分布等等)Sanger的酶降解测序法的酶降解测序法(链终止法链终止法)这项技术的关键是在这项技术的关键是在DNADNA的聚合过程中依赖特殊的聚合过程中依赖特殊反应底物反应底物(23(23双脱氧核苷三双脱氧核苷三 磷酸磷酸ddNTPddNTP) )的特异性终止进行的特异性终止进行DNADNA测序。测序。DNA replication: biochemistry22，3ddNTP3ddNTP与普通与普通dNTPdNTP不同之处在同它们在脱氧核糖不同之处在同它们

13、在脱氧核糖的的3 3 位置缺少一个羟基。它们可以在位置缺少一个羟基。它们可以在DNADNA聚合酶作用下聚合酶作用下通过其通过其5 5 三磷酸基团掺入到正在增长的三磷酸基团掺入到正在增长的DNADNA链中，但由链中，但由于没有于没有33羟基，它们不能同后续的羟基，它们不能同后续的dNTPdNTP形成磷酸二酯链，形成磷酸二酯链，因此，正在增长的因此，正在增长的DNADNA链不可能继续延伸。链不可能继续延伸。The Sanger method requiresMultiple copies of single stranded template DNAA suitable primer (a sma

14、ll piece of DNA that can pair with the template DNA to act as a starting point for replication)DNA polymerase (an enzyme that copies DNA, adding new nucleotides to the 3 end of the templateA pool of normal nucleotidesA small proportion of dideoxynucleotides labeled in some way ( radioactively or wit

15、h fluorescent dyes)The template DNA pieces are replicated, incorporating normal nucleotides, but occasionally and at random dideoxy (DD) nucleotides are taken up.This stops replication on that piece of DNAThe result is a mix of DNA lengths, each ending with a particular labeled DDnucleotide.Because

16、the different lengths travel at different rates during electrophoresis, their order can be determined.酶酶法法序序列列分分析析的的原原理理DNA template is denatured to single strands.DNA primer (with 3 end near sequence of interest) is annealed to the template DNA and extended with DNA polymerase.Four reactions are se

17、t up, each containing:DNA templatePrimer annealed to template DNADNA polymerasedNTPS (dATP, dTTP, dCTP, and dGTP)Next, a different radio-labeled dideoxynucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, or ddGTP) is added to each of the four reaction tubes at 1/100th the concentration of normal dNTPs.ddNTPs possess a

18、 3-H instead of 3-OH, compete in the reaction with normal dNTPS, and produce no phosphodiester bond.Manual Dideoxy DNA sequencing-How it works:Whenever the radio-labeled ddNTPs are incorporated in the chain, DNA synthesis terminates.Each of the four reaction mixtures produces a population of DNA mol

19、ecules with DNA chains terminating at all possible positions. Extension products in each of the four reaction mixutes also end with a different radio-labeled ddNTP (depending on the base).Next, each reaction mixture is electrophoresed in a separate lane (4 lanes) at high voltage on a polyacrylamide

20、gel. Electrophoresis at 70C (2 h).Fix gel in HAc, dry gel (1 h). Autoradiography (24-48 h). Pattern of bands in each of the four lanes is visualized on X-ray film.Location of “bands” in each of the four lanes indicate the size of the fragment terminating with a respective radio-labeled ddNTP.DNA seq

21、uence is deduced from the pattern of bands in the 4 lanes.地高辛地高辛, ,生物素生物素: : 用地高辛用地高辛, ,生物素代替发射性同位素示踪测序反应产生物素代替发射性同位素示踪测序反应产物物, ,最后用酶显色反应显示出测序结果最后用酶显色反应显示出测序结果. .荧光标记物荧光标记物ddGTPddATPddTTPddCTP引物标记法测序引物标记法测序(Dye Primer)(Dye Primer)+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddATP (terminator)+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddCTP+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddGTP+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddTTP终止法测序终止法测序(Dye Terminator)unlabeled primertemplate DNA+AmpliTaq