动物肝脏DNA提取和鉴定-实验技术

1、甘肃中医药大学核酸的分类核酸的分类l DNA (DNA (脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸) ) 主要存在于细胞核的染色体中。主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量核外也有少量DNADNA，如线粒体，如线粒体DNADNA（mtDNAmtDNA），叶绿），叶绿体体DNADNA（cpDNAcpDNA），质粒），质粒DNADNA。l RNARNA（核糖核酸）（核糖核酸） 存在于细胞质中，如存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，外，还有非细胞形式存在的病毒和噬还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含菌体，其

2、或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。核酸的理化性质核酸的理化性质l在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在l微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂l在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。lDNADNA溶液粘度很大，溶液粘度很大，RNARNA的粘度较小的粘度较小l在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来l 浓盐法：浓盐法：利用利用RNA和和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解在不同盐浓度溶液中的溶解度不同

3、将二者分离。度不同将二者分离。l离子去污剂法：离子去污剂法：利用利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取化铵）等去污剂使蛋白质变性，直接从生物材料中提取DNA。l 苯酚抽提法：苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与的降解。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA连接键连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。溶于水相。基因组基因组DNA

4、的提取方法的提取方法 核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用：去垢剂的作用： 1 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；来； 3 3对对RNase、DNase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。如：如：SDS、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠、4-4-氨基水杨酸钠、萘氨基水杨酸钠、萘-1

5、.5-1.5-二磺二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠酸钠、三异丙基萘磺酸钠 作用：作用： 1. 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。 2.2.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作活性和破裂细胞的作用。用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸制备中常用的蛋白质变性剂核酸制备中常用的蛋白质变性剂l核酸制备中常用的酶核酸制备中常用的酶 DNase: :降解降解DNADNA RNase：降解：降解RNARNA 蛋白酶蛋白酶K K：降解蛋白质：降解蛋白质

6、 溶菌酶溶菌酶：破碎细胞：破碎细胞 核酸提取的主要步骤核酸提取的主要步骤l沉淀核酸，去除盐类，沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质有机溶剂等杂质l除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、氯仿抽提、蛋白变性剂（蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤等）、蛋白酶处理、高盐洗涤l除去其它不需要除去其它不需要的核酸分子的核酸分子l破碎细胞：研磨、组织匀浆、破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、超声、冻融；异硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶）碱裂解；酶解（溶菌酶）注意事项注意事项l加入加入R

7、NA降解降解酶除酶除RNAl加入加入DNA酶抑制剂：柠酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等、苯酚等l蛋白变性剂反应蛋白变性剂反应不宜过于剧烈不宜过于剧烈l 避免过酸、避免过酸、过碱及高温过碱及高温一、实验目的：一、实验目的： 1、学习并掌握用浓盐法从动物组织中的提取DNA方法及其原理。 2、学习和掌握二苯胺法测定DNA的原理和方法。二、实验原理二、实验原理l溶于高盐溶液（溶于高盐溶液（1mol/L）, 微溶于低盐溶液（微溶于低盐溶液（0.14mol/L）l溶于低盐溶液（溶于低盐溶液（0.14mol/L） 微溶于高盐溶液（微溶于高盐溶液（1mol/L）

8、p 核酸含量的测定方法：紫外吸收法、定磷法和分别针核酸含量的测定方法：紫外吸收法、定磷法和分别针对对DNA和和RNA的颜色反应方法。的颜色反应方法。p 脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境酸性环境中变成中变成-羟基羟基-酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，在595nm处有最大的吸收处有最大的吸收 。p DNA20400微克范围内，光密度与微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，的浓度成正比，在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应的灵敏度。 三、实验试剂三、实验试剂l95%冷

9、乙醇、冷乙醇、NaCl固体固体l二苯胺：称取纯二苯胺二苯胺：称取纯二苯胺1g溶于溶于100ml冰醋酸中，加入冰醋酸中，加入10ml过过氯酸，混匀。临用时加氯酸，混匀。临用时加1ml1.6%乙醛溶液，所配置试乙醛溶液，所配置试剂应为无色。剂应为无色。l0.14molL NaCl0.05molL 柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液(PH=6.8)lDNA标准液标准液200ug/ml:DNA钠钠盐用盐用5mmol/L的的NaOH配制。配制。l氯仿氯仿/异戊醇异戊醇=20：1（V/V）l5% SDS组织捣碎匀浆机组织捣碎匀浆机猪肝猪肝8g匀匀 浆浆16ml的的 柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液离心，离心，400

10、0r/min ,10min上清（弃掉）上清（弃掉）沉淀沉淀沉淀沉淀25ml缓冲液洗涤缓冲液洗涤离心，离心，4000r/min ,20min上清（弃掉）上清（弃掉）40ml的的 柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液沉淀沉淀21ml氯仿氯仿/异戊醇异戊醇4ml 5% SDS振荡振荡 30 min（保鲜膜封口）（保鲜膜封口）加入加入3.6gNaCl 固体，固体，终浓度为终浓度为1mol/L离心，离心，3500r/min ,20min吸取上清（量取体积）吸取上清（量取体积）95%冷乙醇（缓慢加入）边冷乙醇（缓慢加入）边加边朝一个方向缓慢搅动加边朝一个方向缓慢搅动DNA粗制品粗制品除去蛋白质的方法除去蛋白质的方

11、法 lSDS（十二烷基硫酸钠）等去（十二烷基硫酸钠）等去污剂使蛋白质变性，可以直接污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取从生物材料中提取DNAl防止防止DNA酶的降解，提取时可酶的降解，提取时可加入适量加入适量EDTA（乙二胺四乙（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低酸）、柠檬酸，以降低DNA酶酶的活性的活性l氯仿一异成醇使蛋白氯仿一异成醇使蛋白质变性，离心除去变质变性，离心除去变性蛋白质性蛋白质DNA的定量测定的定量测定lDNA粗品用粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至溶解并定容至50ml，作为待测品。，作为待测品。l 混匀，混匀，60水浴保温水浴保温45min，冷却后，冷却后，595nm处，比色。处，比色。l以吸光度以吸光度A595nm对对DNA含量（含量（ug）作图，）作图， 绘制标准曲线。绘制标准曲线。l从标准曲线上查出样品的从标准曲线上查出样品的DNA含量。含量。l计算计算100g猪肝中猪肝中DNA的含量：的含量： 待测样品中待测样品中DNA的质量的质量25(稀释倍数稀释倍数) 称取猪肝的质量称取猪肝的质量=l 匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。l固体固体NaCl应磨碎，加入应分批缓慢加入，边加边摇，应磨碎，加入应分批缓慢加入，边加边摇，避免局部浓度过大或者未及溶解而沉入氯仿层