第四章PCR技术

1、书上第书上第5章章 PCR相关技术的发展相关技术的发展一、一、RNA的聚合酶链反应的聚合酶链反应RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction ) RTPCR是一种将是一种将cDNA合成与合成与PCR技术技术结合结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对要用于对表达信息进行检测或定量分析表达信息进行检测或定量分析，还可以用来检测基因表达差异而不必构建还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆文库克隆cDNA。 RT-PCR先在反转录酶的作用下以先在反转录酶的作用下以mRNA为为模板合成模板

2、合成cDNA，再以再以cDNA为模板进行为模板进行PCR反反应，这样低丰度的应，这样低丰度的mRNA被扩增放大，易于检被扩增放大，易于检测。测。RT-PCR是一种快速、简便且敏感性极高的是一种快速、简便且敏感性极高的检测检测RNA的方法，运用此法可检测单个细胞中的方法，运用此法可检测单个细胞中少于少于l0个拷贝的特异个拷贝的特异RNA。 RT-PCR可应用于：可应用于：（1）对基因转录产物进行定性与定量的检测。）对基因转录产物进行定性与定量的检测。（2）对基因转录中剪切与拼接的检测。）对基因转录中剪切与拼接的检测。（3）克隆）克隆cDNA及合成及合成cDNA探针、改造探针、改造cDNA序列等。

3、序列等。 n 对基因转录产物进行定性与定量的检测，对基因转录产物进行定性与定量的检测，相对传统的检测方法，如相对传统的检测方法，如Northern杂交、斑点杂交、斑点杂交（杂交（ RNA dot）等而言，）等而言，RTPCR的精确的精确度更高，且样品用量显著减少。利用度更高，且样品用量显著减少。利用RTPCR对难检测的基因进行相应的检测与研究更对难检测的基因进行相应的检测与研究更易获得成功。另外，还能同时分析多个差别基易获得成功。另外，还能同时分析多个差别基因的转录。如植物方面，因的转录。如植物方面，RTPCR常常用于常常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在研究环境胁迫对植物基因表达的

4、影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。表达的差异性。n对基因转录中剪切与拼接的检测：对基因转录中剪切与拼接的检测：如果如果RTPCR引物确定了引物确定了mRNA片段，片段，根据其是否包含某个外显子，将产生两根据其是否包含某个外显子，将产生两种差别种差别DNA片段，进而在凝胶电泳图谱片段，进而在凝胶电泳图谱上显示出迁移率不同的条带。因为转座上显示出迁移率不同的条带。因为转座子涉及到特定的子涉及到特定的DNA序列及转座酶识别序列及转座酶识别位点，用位点，用RTPCR方法可以较精确地研方法可以较精确地研究转座过程的分子机制。究转座过

5、程的分子机制。 反转录步骤cDNA cDNA 链合成链合成, , 互补互补 mRNAmRNA链，一般利用链，一般利用polyTpolyT作作为引物，也可用特异性的序列作为引物为引物，也可用特异性的序列作为引物G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAAReverse transcriptasemRNAcDNAT T A G G A GTTTTTTTTTTTTTTT逆转录逆转录polyTpolyT引物引物PCR步骤步骤电泳分离不同大小的电泳分离不同大小的DNADNA片断片断 RT-PCR中的关键步骤是中的关键步骤是RNA的反转录，的反转录，要求要求RNA模板必须是完整的模板必

6、须是完整的，且不含，且不含DNA、蛋白质等杂质。若蛋白质等杂质。若RNA模板中污染了微量模板中污染了微量DNA，扩增后会出现特异扩增后会出现特异DNA的的PCR产物产物，而而cDNA扩增产物却很少，必要时可用无扩增产物却很少，必要时可用无RNase的的DNase处理反转录产物，消除处理反转录产物，消除DNA后后，再进行再进行PCR。蛋白质末除净可与蛋白质末除净可与RNA结合，结合，从而影响反转录和从而影响反转录和PCR反应。反应。 常用反转录酶有两种，即禽类成髓常用反转录酶有两种，即禽类成髓细胞性白血病毒（细胞性白血病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）和莫洛尼鼠

7、类白血病毒（和莫洛尼鼠类白血病毒（Moloney murine leukemia virus，MoMLV）的反转录酶。的反转录酶。 AMV反转录酶由两个不同的亚基组成，反转录酶由两个不同的亚基组成，具有较强的具有较强的RNaseH活性，可水解活性，可水解RNA模模板，以板，以RNA为模板合成单链为模板合成单链DNA的酶活性的酶活性最适作用温度为最适作用温度为42。MoMLV反转录酶反转录酶由一条多肽链组成，最适作用温度为由一条多肽链组成，最适作用温度为37，RNaseH活性较低，适于合成大片段全长活性较低，适于合成大片段全长cDNA。但当模板但当模板RNA的二级结构影响反的二级结构影响反转录反

8、应时，用转录反应时，用AMV反转录酶更合适，因反转录酶更合适，因为较高的反应温度可消除为较高的反应温度可消除RNA二级结构的二级结构的影响。此外，这两种反转录酶的缓冲液有影响。此外，这两种反转录酶的缓冲液有所不同。所不同。 近来从嗜热栖热菌近来从嗜热栖热菌HB8中分离得到的中分离得到的Tth耐热耐热DNA聚合酶，此酶还具有反转录酶活性，聚合酶，此酶还具有反转录酶活性，95时该时该酶的半衰期为酶的半衰期为20分钟，具有分钟，具有5-3外切酶活性，无外切酶活性，无3-5外切酶活性，利用外切酶活性，利用Tth耐热耐热DNA聚合酶同时聚合酶同时具有反转录酶的特点，可简化具有反转录酶的特点，可简化RT-

9、PCR，且比用且比用Taq DNA聚合酶的反应敏感性高聚合酶的反应敏感性高100倍，因此倍，因此Tth聚合酶聚合酶比比Taq DNA聚合酶更优越。聚合酶更优越。 TthDNA聚合酶作用温度高，可消除聚合酶作用温度高，可消除RNA的二的二级结构对反转录反应的影响，增加级结构对反转录反应的影响，增加TthDNA聚合酶聚合酶的反转录活性，可增加的反转录活性，可增加RT-PCR反应敏感性。反应敏感性。TthDNA聚合酶的缺点是其反转录酶活性需聚合酶的缺点是其反转录酶活性需Mn2+，而而Mn2+会降低会降低DNA聚合酶的忠实性，聚合酶的忠实性，TthDNA聚合聚合酶催化聚合反应的错误掺入率为酶催化聚合反

10、应的错误掺入率为1/500。二、二、cDNAcDNA末端快速扩增末端快速扩增（rapid amplification of rapid amplification of cDNAcDNA ends ends，RACERACE） 尽管尽管cDNAcDNA克隆技术发展迅速，但获得克隆技术发展迅速，但获得mRNAmRNA的全长转录的全长转录物物cDNAcDNA往往是比较困难的。往往是比较困难的。尤其是获得尤其是获得mRNAmRNA的的55端。端。这这是因为是因为mRNAmRNA反转录本身的限制。反转录本身的限制。mRNAmRNA的二级结构、转录条的二级结构、转录条件和转录引物均影响这一过程。目前，通

11、过预处理减少件和转录引物均影响这一过程。目前，通过预处理减少mRNAmRNA二级结构，改善反转录条件和使用特异引物延伸的二级结构，改善反转录条件和使用特异引物延伸的cDNAcDNA等一系列措施便全长等一系列措施便全长cDNAcDNA的克隆成功率增加。这种过的克隆成功率增加。这种过程需要几周乃至数月才能完成。程需要几周乃至数月才能完成。PCRPCR技术为技术为cDNAcDNA克隆方法克隆方法开辟了新纪元。使用开辟了新纪元。使用cDNAcDNA末端的快速扩增可在末端的快速扩增可在1 1一一2 2天内完天内完成反转录成反转录cDNAcDNA的分析。的分析。 我们知道，在有些我们知道，在有些mRNA分

12、子中，从分子中，从poly（A）尾到尾到5帽子之间有一段很长的距离，因帽子之间有一段很长的距离，因而仅利用而仅利用poly（A）尾来获得全长尾来获得全长cDNA可能可能比较困难，甚至无法实现。因为长的比较困难，甚至无法实现。因为长的mRNA的反转录过程往往会提前终止，的反转录过程往往会提前终止，PCR扩增也扩增也存在同样的问题。存在同样的问题。 RACE技术正是为了解决这种困难而设计技术正是为了解决这种困难而设计的一种用于的一种用于获取获取mRNA末端信息末端信息（尤其是（尤其是5端序列）的有效方法。应用端序列）的有效方法。应用RACE技术能扩增技术能扩增从从mRNA内部已知序列处内部已知序列

13、处至至3 poly（A）尾尾或至或至5人工加上的锚定序列之间的区段。由人工加上的锚定序列之间的区段。由于在仅已于在仅已知单侧序列知单侧序列可供设计特异性引物时可供设计特异性引物时应用应用RACE技术仍能完成扩增，因而技术仍能完成扩增，因而RACE又又称为称为单侧单侧PCR （single-side PCR）；）；而且而且RACE技术应用了供引物附着的锚序列，因此技术应用了供引物附着的锚序列，因此RACE又属于又属于锚定锚定PCR。 所谓所谓RACERACE是指以是指以mRNAmRNA为模板，反转录合为模板，反转录合成成cDNAcDNA的第一条链，然后用的第一条链，然后用PCRPCR技术扩增出技

14、术扩增出从某个特定位点到从某个特定位点到33端或到端或到55端之间的未知端之间的未知核苷酸序列。因而又可分为核苷酸序列。因而又可分为33RACERACE和和55RACERACE两种，此处的两种，此处的33和和55是针对是针对mRNAmRNA而言的，如而言的，如55RACERACE是指特定位点到相应于是指特定位点到相应于RNA5RNA5端的序端的序列。列。 特定位点特定位点 是指是指cDNAcDNA基因内位点，依据基因内位点，依据此位点所设计的此位点所设计的PCRPCR引物称为基因特异性引引物称为基因特异性引物物( (gene-specific primergene-specific prime

15、r，GSP)GSP)。 RACE所使用的起始总所使用的起始总RNA或或mRNA仅需仅需约约lg甚至少到甚至少到lng，可扩增出丰度低于可扩增出丰度低于0.00001%的的RNA，甚至仅有几个甚至仅有几个RNA分子分子亦可被检测出来，因此亦可被检测出来，因此RACE技术可直接用技术可直接用于扩增和克隆低丰度于扩增和克隆低丰度mRNA的末端。的末端。 以以oligo(dT)n和被称为锚定引物和被称为锚定引物(anchored primer)或或接头接头(adaptor)的序列组成的引物的序列组成的引物QT反转录反转录mRNA模板模板得到第一条得到第一条cDNA链链.加入加入RNaseH降解降解RN

16、A模板。然后用含有部分锚定引物模板。然后用含有部分锚定引物序列的引物序列的引物Q0与基因特异性引物与基因特异性引物GSPl进行第一轮扩增，进行第一轮扩增，得到双链得到双链cDNA第二轮及以后的扩增刚采用内部引物第二轮及以后的扩增刚采用内部引物(nested primer)Ql和基因特异和基因特异性引物性引物GSP2进行，以防止产生非特异性扩增产物。进行，以防止产生非特异性扩增产物。用基因特异性引物用基因特异性引物GSP-RT反转录反转录mRNA获得获得cDNA第一条链第一条链然后用末端转移酶在然后用末端转移酶在cDNA5端加上端加上Poly(A)尾巴尾巴紧接着先以紧接着先以QT引物和引物和GS

17、P-RT引物进行引物进行PCR扩扩增获得增获得cDNA第二条链第二条链 再以再以Q0和和GSP-RT上游引物上游引物GSPl扩增扩增cDNA;最后采用内部最后采用内部引物引物Ql和和GSP-RT下游引物下游引物GSP2进行随后的多轮进行随后的多轮PCR扩增以扩增以提高产物特异性。提高产物特异性。扩增后得到的双链扩增后得到的双链cDNA用限制性核酸内切用限制性核酸内切酶酶切和杂交分析并进行克隆，得到酶酶切和杂交分析并进行克隆，得到5特异特异性和性和3特异性的特异性的cDNA文库。从两个有互相文库。从两个有互相重叠顺序的重叠顺序的5和和3RACE产物中可以获得产物中可以获得全长全长cDNA，或者可

18、以先分析或者可以先分析5和和3端顺端顺序，合成相应引物扩增出全长序，合成相应引物扩增出全长cDNA。显然，显然，RACE不仅可以避免常规不仅可以避免常规PCR扩增效率低和扩增效率低和特异性差的问题，而且可以简便快速地获得特异性差的问题，而且可以简便快速地获得cDNA文库中不易得到的全长文库中不易得到的全长cDNA克隆。克隆。（三）新型（三）新型RACERNA连接酶介导的连接酶介导的RACE RNA连接酶介导的连接酶介导的RACE与传统与传统RACE的最主要区别在于：在反转录这一步骤之的最主要区别在于：在反转录这一步骤之前，锚定引物直接加在前，锚定引物直接加在mRNA的的5端端.RACE的应用的

19、应用1、在克隆、在克隆cDNA方面的应用方面的应用1)获取低丰度获取低丰度mRNA的的cDNA克隆方面与建克隆方面与建立立cDNA文库相比具有明显优势。文库相比具有明显优势。2)从从cDNA文库得到的文库得到的cDNA克隆经常会出现克隆经常会出现5末端残缺的现象，相比之下，用末端残缺的现象，相比之下，用RACE技术则能获得技术则能获得cDNA完整的完整的5末端信息。末端信息。3)用常规的用常规的RT-PCR扩增扩增cDNA，必须已知必须已知mRNA双侧的序列，而双侧的序列，而RACE技术在仅已知技术在仅已知单侧序列时仍能完成扩增反应，因而适用范单侧序列时仍能完成扩增反应，因而适用范围更加广泛。

20、围更加广泛。 2、在基因表达检测方面的应用、在基因表达检测方面的应用 应用应用RACE技术可以快速、简便地检测基因技术可以快速、简便地检测基因的表达情况。在增加使用与靶的表达情况。在增加使用与靶mRNA同源的异同源的异种种mRNA作为竞争性的内标准之后，作为竞争性的内标准之后，RACE作作为一种特定的为一种特定的RT-PCR也可用于测定低丰度靶也可用于测定低丰度靶mRNA的含量，尤其适用于检测稀少样品中的的含量，尤其适用于检测稀少样品中的mRNA，甚至可用于研究单个细胞在特定发育甚至可用于研究单个细胞在特定发育时期及环境下基因的不同表达状况，而如此高时期及环境下基因的不同表达状况，而如此高的灵

21、敏度是传统的的灵敏度是传统的Northern杂交分析和杂交分析和RNase保护鉴定所无法达到的。保护鉴定所无法达到的。三、反向三、反向 PCR 对于已知序列的对于已知序列的DNA片段只要设计合适的片段只要设计合适的引物，常规引物，常规PCR就可扩增位于两个引物之间就可扩增位于两个引物之间的的DNA片段，但不能扩增引物外侧的片段，但不能扩增引物外侧的DNA。然而在分子生物学研究中，经常需要鉴定紧然而在分子生物学研究中，经常需要鉴定紧邻已知顺序的邻已知顺序的DNA片段，如编码片段，如编码DNA的上游的上游及下游区城、转位因子插入位点等。在及下游区城、转位因子插入位点等。在PCR技术出现以前，要测定

22、技术出现以前，要测定已知基因已知基因两侧未知的两侧未知的序列序列是非常繁杂的。是非常繁杂的。 一般都需先用限制性内切酶进行消化，再一般都需先用限制性内切酶进行消化，再用已知顺序的侧翼区段作为探针进行用已知顺序的侧翼区段作为探针进行Southern杂交，来鉴定合适大小的末端片段，杂交，来鉴定合适大小的末端片段，然后从制备性凝胶上纯化这些片段，克隆到然后从制备性凝胶上纯化这些片段，克隆到载体上，得到的重组子进一步与已知顺序的载体上，得到的重组子进一步与已知顺序的侧翼区探针杂交以鉴定合适的克隆。为测定侧翼区探针杂交以鉴定合适的克隆。为测定未知的侧翼区顺序还常需亚克隆出各种片段。未知的侧翼区顺序还常需

23、亚克隆出各种片段。该方法的基础是将侧翼区该方法的基础是将侧翼区DNA转变成为引物内围区域。转变成为引物内围区域。其做法是首先用合适的限制性内切酶在已知其做法是首先用合适的限制性内切酶在已知DNA序列之外切序列之外切割，再将形成的限制性割，再将形成的限制性DNA片段自身连接成环状分子。片段自身连接成环状分子。环化环化DNA线性化时，限制性内切酶唯一切点必须位于核心线性化时，限制性内切酶唯一切点必须位于核心DNA上上所用的引物仍然和已知序列两端顺序同源，不同的所用的引物仍然和已知序列两端顺序同源，不同的是它们的是它们的3端方向转向侧翼区的未知端方向转向侧翼区的未知DNA序列。序列。经过一般的经过一

24、般的PCR扩增之后，其产物就是该环状分子中未知序列的扩增之后，其产物就是该环状分子中未知序列的DNA片段。也可将环化片段。也可将环化DNA线性化后再进行线性化后再进行PCR，有报道认为，用有报道认为，用线性化线性化DNA进行进行IPCR扩增效率可提高扩增效率可提高100倍。倍。 限制性内切酶的选择对限制性内切酶的选择对IPCR很重要，将已知的很重要，将已知的DNA序列序列称做核心称做核心DNA，第一步消化基因组第一步消化基因组DNA模板时，必须选择核模板时，必须选择核心心DNA上无酶切位点的限制性内切酶，若产生黏性末端上无酶切位点的限制性内切酶，若产生黏性末端DNA片段则更易于环化。此外，限制

25、性内切酶消化后产生的片段则更易于环化。此外，限制性内切酶消化后产生的DNA片段大小要适当，太短（片段大小要适当，太短（200300bp）则不能环化，太长的则不能环化，太长的DNA片段则受片段则受PCR本身扩增片段有效长度的限制。本身扩增片段有效长度的限制。 环化环化DNA线性化时，限制性内切酶唯一切点必线性化时，限制性内切酶唯一切点必须位于核心须位于核心DNA上，未知序列无此酶的识别位点。上，未知序列无此酶的识别位点。当酶切后两个末端不互补而无法直接连接时，可当酶切后两个末端不互补而无法直接连接时，可用用Klenow或或T4 DNA聚合酶先将其补成平末端后聚合酶先将其补成平末端后再环化。通常在

26、连接前，需要用酚抽提或加热使再环化。通常在连接前，需要用酚抽提或加热使限制性内切酶变性失活。限制性内切酶变性失活。应用上述方法，对研究转位因子、反转录病毒以及所有应用上述方法，对研究转位因子、反转录病毒以及所有可以整合或转位到基因组中的其他可以整合或转位到基因组中的其他DNA序列，都可收到序列，都可收到良好的效果。其主要优点是简单、快速，可以研究许多良好的效果。其主要优点是简单、快速，可以研究许多独立的克隆。独立的克隆。但反向但反向PCR也有其局限性。第一，由于旁侧序列是未知也有其局限性。第一，由于旁侧序列是未知的，故在选择合适的限制性内切酶时，常需要用几种酶的，故在选择合适的限制性内切酶时，

27、常需要用几种酶做预试验或选择几种可以产生片段大小合适的酶；第二，做预试验或选择几种可以产生片段大小合适的酶；第二，许多常用的限制性内切酶不但在插入序列上有切点，同许多常用的限制性内切酶不但在插入序列上有切点，同时在载体上不合适的位置也有切点。时在载体上不合适的位置也有切点。四、四、实时实时荧光定量聚合酶链反应荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR Fluorescence quantitative PCR） (Real time Quantitative PCR)实时荧光定量实时荧光定量PCR定义定义 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧，利用荧光信号累积光信号累积

28、实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 滤镜轮滤镜轮CCD相机相机光源光源灯灯滤光镜滤光镜96孔板孔板多元镜多元镜双色镜双色镜夫累尔透镜夫累尔透镜96孔透镜孔透镜组组反射镜反射镜光学原理图常常 规规 PCRPCR技术：技术： 对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测检测实时定量实时定量PCRPCR技术：技术： 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测

29、PCRPCR扩增反应扩增反应中中每一个循环扩增产物量的变化每一个循环扩增产物量的变化，通过，通过CtCt值值和标和标准曲线的分析对准曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量分析定量分析实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理定量原理原理定量原理介绍三个概念：介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分进行定量分析析扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：横坐标：扩增循环数（扩增循环数（CycleCycle）；）；纵坐标：纵坐标：荧光强度荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的

30、收集每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件扩增曲线扩增曲线实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光阈值荧光阈值荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold ）：q 前前1515个循环信号作为荧光本底信个循环信号作为荧光本底信号（号（baselinebaseline），），即即样本的荧光背景样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是荧光域值的缺省设置是3 31515个循个循环的荧光信号的标准偏差的环的荧光信号的标准偏差的1010倍倍q 手动手动 设置：原则要大于样本的荧设置：原则要大于样本的

31、荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入同时要尽量选择进入指数指数期的最初阶期的最初阶段，并且保证回归系数大于段，并且保证回归系数大于0.990.99q 真正的信号真正的信号: :荧光信号超过域值荧光信号超过域值实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值Ct值的值的定义定义： PCRPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增的阈值时所经过的扩增循环次数循环次数C(t) value C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold，CtCt

32、值的含义是：值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图环数（如图1 1所示）。所示）。 Ct值的确定值的确定 Ct值的重现性横轴：横轴：PCRPCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量Ct值的特点值的特点：相同模板进行相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性值则极具重现性实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反应： X=X0*2n非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X

33、：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 - - 标准曲线标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量Sample绝对定量绝对定量25非非特异性荧光标记：特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记方法方法 1 -1 -SYBR Green 法SYBR Gree

34、n SYBR Green 法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation温度温度荧光强度荧光强度Tm-dIdTTmSYBR Green SYBR Green 法法 融解曲线分析融解曲线分析融解曲线分析，

35、单一峰融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光无非特异性荧光定量准确定量准确融解曲线分析，出现杂峰融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确光，因此定量不准确非非特异性产物特异性产物Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少q Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化反

36、应体系的建立及优化:1.SYBR Green 使用浓度使用浓度:太高抑制太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度的浓度:可以降低到可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物以减少非特异性产物4.反应反应Buffer 体系的优化体系的优化5.反应温度和时间参数反应温度和时间参数:由酶和引物决定由酶和引物决定6.其他与常规其他与常规PCR相同相同SYBR Green SYBR Green 法法 应用范围应用范围q 起始模板的测定q 基因型

37、的分析q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBR Green SYBR Green 法法 优缺点优缺点 q 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNAq 使用方便 -不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点与目标序列互补方法方法2 -2 -TaqManTaqMan法法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R) ，如，如FAM

38、、VIC等等 v 3端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)v 探针完整，探针完整，R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被Q基团吸收基团吸收 ，无荧光，无荧光， R与与Q分开，发荧光分开，发荧光v Taq酶有酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针外切核酸酶活性，可水解探针TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqManTaqMan 法法 PCRPCR反应的建立反应的建立1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段

39、400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同TaqManTaqMan法法 优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定q 设计相对简单 -与目标序列某一区域互补q重复性比较好优 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点方法方法 3- Molecular

40、beacon 3- Molecular beacon 法法( (分子信标分子信标) )标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素 淬灭剂发夹型杂交探针发夹型杂交探针Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 工作原理工作原理q 荧光共振能量转移（FRET）q 探针与DNA杂交时产生荧光 -变性过程：产生非特异性荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光 信号Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 应用范围应用范围 q 起始模板的定量q 基因

41、型分析q 产物鉴定q SNP（单核苷酸多态性）分析Molecular beacon (Molecular beacon (分子信标分子信标) ) 优缺点优缺点q高高特异性：特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一q荧光背景低荧光背景低优 点q 只能用于一个特定目标q 设计困难q 价格比较高缺 点讲讲 座座 提提 纲纲q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的几

42、种方法介绍的几种方法介绍q 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验设计及应用实验设计及应用实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样品标准样品相对定量中的内标相对定量中的内标 内标通常是内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒已知拷贝数的质粒DNA DNA 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 标准样

43、品标准样品用于生成标准曲线的样品如何设定？用于生成标准曲线的样品如何设定？含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的含有和待测样品相同扩增片段的cDNAcDNA紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度根据质粒或根据质粒或cDNAcDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀分子量换算成拷贝数，做系列稀释释实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 定量方定量方法法q 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线到标准曲线q 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之相对定量确

44、定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）间基因的表达差异（不同时相）实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 绝对定量绝对定量方法方法实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR法法 TaqManTaqMan法举法举例例 TaqManTaqMan法举例法举例 标记探标记探针针使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量q FamFam标记目标基因探针标记目标基因探针q VIC VIC标记看家基因探针标记看家基因探针TaqManTaqMan法举例法举例 材料准材料准备备q从正常乳腺组织中提取的从正常乳腺组织中提取的总总 RNA RNA q从乳腺癌组织中提取的从乳腺癌组织中提取的 总总R

45、NARNAq含含 ERBB2 and GAPDH ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准的质粒用于生成标准曲线曲线q单双通道同时进行，独立分析单双通道同时进行，独立分析TaqManTaqMan法举例法举例 癌症标记物癌症标记物表达表达Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 定量定量Copies ng/ l Total RNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB21095 1052213024922.16 X

46、GAPDH95500857301360001308001.45 XTaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 定量定量分析分析ERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.0172492/130800 = 0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180.018/ 0.011GraphCopies ng/ l Total RNATaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 表达表达差异差异HealthyTissueCarc.Ti

47、ssueRelative ExpressionERBB2的表达差异TaqManTaqMan法举例法举例 实验结果实验结果 讨论讨论通过通过RT-qPCR成功检测了成功检测了ERBB2基基因在不同组织的因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌表达差异；在乳腺癌组织中，组织中，ERBB2的表达量是正常水平的表达量是正常水平的的1.8倍倍扩增曲线：域值和Ct值循环数Cycle NumberRn (荧光信号)Rn (荧光信号)循环数Cycle Number线性增长期指数增长期平台期定量PCR原理标准曲线起始拷贝数或起始浓度Ct扩增报告荧光报告荧光淬灭基团淬灭基团535535正向引物正向引物反向引物反向引物T

48、aqMan 探针探针RQ报告荧光报告荧光淬灭基团淬灭基团置换535535RQ正向引物正向引物TaqMan 探针探针反向引物反向引物535535QR正向引物正向引物反向引物反向引物切割扩增完成535535RQ正向引物正向引物反向引物反向引物定量PCR仪应用定量检测定量检测E绝对定量：基因表达研究、转基因食品检绝对定量：基因表达研究、转基因食品检测、病原体检测测、病原体检测E相对定量：基因在不同组织中的表达差异、相对定量：基因在不同组织中的表达差异、药物疗效考核药物疗效考核点突变检测点突变检测E与疾病相关的等位基因点突变检测与疾病相关的等位基因点突变检测ESNPSNP检测检测实时定量结果20K,1

49、0K,5K,2.5K和1K扩增曲线(每组重复四次)“未知样品”10K和5K扩增曲线(每组重复36次)定量的线性范围50 - 5x108扩增曲线50 - 5x108标准曲线n基因在不同组织中的表达差异基因在不同组织中的表达差异n药物疗效考核药物疗效考核n耐药性研究耐药性研究 相对定量研究应用三:突变检测，SNP分析，等位基因分析什么是SNP?单点核苷酸多态性Single Nucleotide PolymorphismsAACCTGCATAATGCCAGAACCTGCAGAATGCCAG5核酸酶SNP试验淬灭基团:TAMRA或MGB/NFQPCR后鉴定FAM=等位基因等位基因II纯合子纯合子VIC

50、=等位基因等位基因I纯合子纯合子 FAM+VIC=等位基因等位基因I、II杂合子杂合子等位基因鉴定(SNP检测)结果终点结果1/11/2 杂合子2/2空白对照实时结果实时结果突变检测GCACFAMVICGTATFAMVICNFQ MGBNFQ MGBNFQ MGBNFQ MGB正常正常(Allele 1) 只有VIC 绿色荧光突变突变(Allele 2) 只有FAM 蓝色荧光TaqMan MGB探针结构NFQMGBRNFQMGBR报告荧光无荧光淬灭基团Non-Fluorescent Quencher小沟结合物Minor Groove Binder一、不对称一、不对称 PCRPCR 因因PCRP

51、CR反应中使用的反应中使用的两种引物浓度两种引物浓度不同，因不同，因此称为不对称此称为不对称PCRPCR，不对称不对称PCR（asymmetric PCR）的目的是扩增产生的目的是扩增产生特异长度的单链特异长度的单链DNA。此法产生的此法产生的单链单链DNADNA可用做可用做杂交探针或杂交探针或DNADNA测序的模板测序的模板。 n其其原理原理为为PCR反应中采用两种不同浓度反应中采用两种不同浓度的引物，经若干轮循环后，低浓度的引的引物，经若干轮循环后，低浓度的引物被消耗尽，以后的循环只产生高浓度物被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量单链引物的延伸产物，结果产生大量单链

52、DNA。进行不对称进行不对称PCRPCR有两种方法：有两种方法：（1 1）PCRPCR反应开始时即采用不同浓度的引物。反应开始时即采用不同浓度的引物。（2 2）进行二次）进行二次PCRPCR扩增，第一次扩增，第一次PCRPCR用等浓度的引用等浓度的引物，以期获得较多的目的物，以期获得较多的目的DNADNA片段，提高不对称片段，提高不对称PCRPCR产率，取第一次扩增产物（含双链产率，取第一次扩增产物（含双链PCRPCR片段）用单片段）用单引物进行第二次引物进行第二次PCRPCR扩增产生单链扩增产生单链DNADNA。第一种方法的缺点第一种方法的缺点是只能用限定浓度的引物，大大是只能用限定浓度的引

53、物，大大地降低了地降低了PCRPCR产率，此外，当引物缺乏、有游离产率，此外，当引物缺乏、有游离dNTPdNTP存在时，存在时，PCRPCR的特异产物和非特异产物会相互的特异产物和非特异产物会相互引发新链的合成，引发新链的合成，降低反应的特异性降低反应的特异性。所以，不对。所以，不对称称PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP浓度应比标准浓度应比标准PCRPCR反应低反应低。第二种方法由于第一次扩增产生大量的目的第二种方法由于第一次扩增产生大量的目的DNADNA，直接将目的直接将目的DNADNA片段从琼脂糖凝胶中回收，除去不片段从琼脂糖凝胶中回收，除去不需要的引物及非特异产物，用单引物进行

54、第二次需要的引物及非特异产物，用单引物进行第二次PCRPCR扩增，此法可提高单链扩增，此法可提高单链DNADNA的产率，甚至可达皮的产率，甚至可达皮摩尔（摩尔（pmolpmol）。）。不足之处是不足之处是二次分离步骤增加二次分离步骤增加PCRPCR污染的几率。污染的几率。 为了克服上述方法的缺点，有人设计同一反应为了克服上述方法的缺点，有人设计同一反应管中的不对称管中的不对称PCRPCR，即即设计第设计第3 3个引物个引物，位于前一，位于前一对引物内侧，其对引物内侧，其TmTm值比前一对引物值比前一对引物TmTm值高值高1010，前若干轮循环采用低温退火，产生大量双链前若干轮循环采用低温退火，

55、产生大量双链DNADNA，后面的循环高温退火，只有第后面的循环高温退火，只有第3 3个引物可与模板结个引物可与模板结合、延伸，结果产生单链合、延伸，结果产生单链DNADNA。 不对称不对称PCRPCR由于只有一个引物延伸，其扩增产由于只有一个引物延伸，其扩增产物不是以指数形式增加，而是线性增加，因此不物不是以指数形式增加，而是线性增加，因此不对称对称PCRPCR较一般较一般PCRPCR产率低，欲获得大量单链产率低，欲获得大量单链DNADNA需需更多的循环，至少要更多的循环，至少要30-4030-40个循环。个循环。 不对称不对称PCR的单链的单链DNA和双链和双链DNA的产量的产量随引物比率的

56、不同而变化。最佳引物比率范围随引物比率的不同而变化。最佳引物比率范围在在1：100到到1：20之间。反应中模板之间。反应中模板DNA的量的量决定获得最多单链决定获得最多单链DNA和最少双链和最少双链DNA的循的循环次数，模板太少则单链环次数，模板太少则单链DNA产生少，太多则产生少，太多则双链双链DNA水平过量。水平过量。 不对称不对称PCRPCR的效率较标准的对称的效率较标准的对称PCRPCR低，这低，这种低效率往往通过增加种低效率往往通过增加PCRPCR循环数得到补偿。循环数得到补偿。如果仍得不到足够的单链如果仍得不到足够的单链DNADNA，可尝试下列改可尝试下列改进方法：进方法：（1 1

57、）改变引物比率，从）改变引物比率，从0.50.5：50 50 pmol5pmol5：50 50 pmolpmol范围内试验；范围内试验；（2 2）最后）最后5 5个循环内补加个循环内补加2 2UTaqDNAUTaqDNA聚合酶；聚合酶；（3 3）试验相反的不对称引物比率；）试验相反的不对称引物比率；（4 4）再增加）再增加510510个循环。个循环。 二、多重二、多重 PCRPCR 普通普通PCRPCR由一对引物扩增只产生一个特异的由一对引物扩增只产生一个特异的DNADNA片片段。许多情况下，欲检测的基因十分庞大，可达上段。许多情况下，欲检测的基因十分庞大，可达上千个千个kbkb，这些这些基因

58、常常多处发生突变或缺失基因常常多处发生突变或缺失。而且。而且这些改变相距数十至数百个这些改变相距数十至数百个kbkb，超过超过PCRPCR扩增扩增DNADNA片片段的长度，欲检测整个基因的异常改变，采用一般段的长度，欲检测整个基因的异常改变，采用一般PCRPCR需分段进行多次扩增，费时费力，采用多重需分段进行多次扩增，费时费力，采用多重PCRPCR（multiplex PCRmultiplex PCR）则可克服上述问题。则可克服上述问题。 多重多重PCRPCR就是首先设计合成位于就是首先设计合成位于多个多个缺失好发缺失好发区域两侧的区域两侧的引物引物，每对引物之间核苷酸长度尽每对引物之间核苷酸

59、长度尽量不同量不同，以使扩增后电泳分析时有各自的条带，以使扩增后电泳分析时有各自的条带位置，然后将多对引物加入反应体系，进行常位置，然后将多对引物加入反应体系，进行常规规PCRPCR扩增，扩增，30-4030-40个循环后，对个循环后，对PCRPCR产物进行电产物进行电泳检测。如果基因某一区段缺失，则相应的电泳检测。如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段泳图谱上此区段PCRPCR扩增产物长度变短或片段消扩增产物长度变短或片段消失，从而发现基因异常。失，从而发现基因异常。DMDDMD是一种常见的致死性是一种常见的致死性X-X-连锁遗传病。杜氏肌营养连锁遗传病。杜氏肌营养不良（不良（Duc

60、hene muscular dystrophyDuchene muscular dystrophy，DMDDMD） 多重多重PCRPCR具有灵敏、快速的特点，特别适具有灵敏、快速的特点，特别适用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与常改变，其结果与SouthernSouthern杂交结果同样可杂交结果同样可靠，且多重靠，且多重PCRPCR尚可检测小片段缺失。尚可检测小片段缺失。 引物的设计及各对引物浓度的确定对多重引物的设计及各对引物浓度的确定对多重PCRPCR的成功尤为重要，各个引物的的成功尤为重要，各个引物的33端要避免互补，端要避免互补