生物分离工程 第五章 层析ppt课件

1、层 析主讲：杨丽芬主讲：杨丽芬1. 起源起源 19031903年，俄国的植物学家年，俄国的植物学家茨维特茨维特（TsweetTsweet）提出。）提出。19011901年的时候开始研究色谱现象。年的时候开始研究色谱现象。19031903年，他将年，他将植物植物叶子叶子的的石油醚提取液石油醚提取液倒入到填装倒入到填装CaCOCaCO3 3的玻璃的玻璃管内，用纯净的管内，用纯净的石油醚淋洗石油醚淋洗，产生了不同的，产生了不同的色带色带，她们分别为胡萝卜素、叶黄素、和叶绿素她们分别为胡萝卜素、叶黄素、和叶绿素A A。所以。所以称之为色谱法（层析）。称之为色谱法（层析）。 层析技术的特点层析技术的特点

2、 分离精度高分离精度高、设备简单设备简单、操作方便操作方便，在物质成分，在物质成分的的定量分析定量分析、检测检测、制备分离制备分离与与纯化纯化方面应用广方面应用广泛，是下游技术加工过程中最重要的纯化技术之泛，是下游技术加工过程中最重要的纯化技术之一。一。 2 3 层析的原理层析的原理 据混合物中，溶质在据混合物中，溶质在互不相溶互不相溶的两相之间的两相之间分配行为分配行为的差别，引起的差别，引起移动速度移动速度的不同而进行分离的方法。的不同而进行分离的方法。 互不相溶的两相分别称为互不相溶的两相分别称为固定相固定相和和流动相流动相，固定相，固定相填充于柱中，在柱的顶端加入一定量的料液后，连填充

3、于柱中，在柱的顶端加入一定量的料液后，连续输入流动相，料液中的续输入流动相，料液中的溶质溶质在在固定相固定相和和流动相流动相中中发生扩散传质，发生扩散传质，产生分配平衡产生分配平衡。分配系数大的溶质分配系数大的溶质在固定相上存的几率大，随流动相移动的速度小；在固定相上存的几率大，随流动相移动的速度小；分配系数小的溶质在固定相上存的几率小，随流动分配系数小的溶质在固定相上存的几率小，随流动相移动的速度大相移动的速度大。 在层析柱出口，各在层析柱出口，各溶质浓度溶质浓度随随时间时间的变化图称作的变化图称作洗洗脱曲线脱曲线。4 5 层析的分类层析的分类 按流动相的按流动相的相态相态：气相层析法气相层

4、析法、液相层析法液相层析法、超临界流体层析法超临界流体层析法。固定相可以是。固定相可以是固体固体、液体液体、以固体为载体的以固体为载体的液体薄层液体薄层。生物物质一般在水溶。生物物质一般在水溶液中，故生物分离一般采用液中，故生物分离一般采用液相层析法液相层析法。 按按固定相形状固定相形状：液相层析液相层析分为分为纸层析纸层析、薄层层薄层层析析、柱层析柱层析。纸层析和薄层层析主要用于。纸层析和薄层层析主要用于分析分析（定性或定量定性或定量），柱层析主要用于），柱层析主要用于制备分离制备分离。 按按操作压力操作压力：以：以固体为固定相固体为固定相的液相层析又分的液相层析又分为为低压低压（t0后输入

5、后输入不含溶质的流动相，则式子的初始和边界条件为：不含溶质的流动相，则式子的初始和边界条件为：当料液量很小式，可认为料液为脉冲输入，上式为洗当料液量很小式，可认为料液为脉冲输入，上式为洗脱曲线，呈脱曲线，呈Poisson分布（泊松分布）。若果分布（泊松分布）。若果N值很大值很大，则溶质的洗脱曲线则溶质的洗脱曲线可用可用Gauss分布分布（正态分布）（正态分布）近似近似，即即15 其中 16 或说明，理说明，理论板数越多论板数越多，洗脱峰越窄洗脱峰越窄，溶质之间的分离，溶质之间的分离程度越好，利用程度越好，利用实测的洗脱峰实测的洗脱峰和式子可计算层析柱的和式子可计算层析柱的理论板数理论板数。17

6、 理论板模型仅用一个理论板模型仅用一个理论板数理论板数描述层析柱的描述层析柱的分离性分离性能能，使用方便，使用方便，特别适合于料液浓度很低的分析过特别适合于料液浓度很低的分析过程程。但是，理论板模型。但是，理论板模型不能确定层析柱的分离性能不能确定层析柱的分离性能的影响因素的影响因素，特别对于料液浓度较高的制备分离过，特别对于料液浓度较高的制备分离过程。程。 轴向扩散模型轴向扩散模型 考虑到溶质在流动向和固定相间的考虑到溶质在流动向和固定相间的传质速率传质速率及流动及流动向的向的流动状态流动状态。该模型假设固定相为均质球形颗粒，。该模型假设固定相为均质球形颗粒，溶质在固定相内溶质在固定相内无对

7、流运动无对流运动，利用，利用均质固相模型均质固相模型进进行物料衡算，最后求出：行物料衡算，最后求出：18 从图上可知，从图上可知，存在某一流速使存在某一流速使HETPHETP最小最小，在此流速下塔板理在此流速下塔板理论数最大，分离效果最好论数最大，分离效果最好。在。在液相层析液相层析的操作条件下，一般的操作条件下，一般分子扩散的影响可忽略不计。分子扩散的影响可忽略不计。因此，因此，为提高分离效果为提高分离效果，可通，可通过过降低流速降低流速或或减小固定相粒径减小固定相粒径来降低来降低HETPHETP，提高理论板数提高理论板数。由于减低流速意味着增加分离由于减低流速意味着增加分离时间，故时间，故

8、采用减小粒径的方法采用减小粒径的方法可同时保证分离操作的速度和可同时保证分离操作的速度和高精度高精度，这是高效液相层析的，这是高效液相层析的理论基础。很短的层析柱具有理论基础。很短的层析柱具有很大的理论板数，对高速度和很大的理论板数，对高速度和高精度的分析非常有利。高精度的分析非常有利。19分离度？分离度？又称为又称为分别率分别率。表示两个。表示两个相邻相邻的的洗脱峰洗脱峰之间的之间的距离距离与两个与两个缝宽的代数平均值缝宽的代数平均值之之比比。 通过通过增大峰间距离增大峰间距离或或降低缝宽降低缝宽可提高溶质之间的分离可提高溶质之间的分离度。度。容量因子容量因子（k）固定相和流动相间固定相和流

9、动相间溶质分配量之比溶质分配量之比。选择性（选择性（）洗脱峰相邻的两种溶质的洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比容量因子之比。20Rs1时，溶时，溶质的分离已质的分离已经较好。一经较好。一般把般把Rs值应值应在在11.3之间之间21 假定曲线呈高斯分布，将假定曲线呈高斯分布，将平均洗脱时间平均洗脱时间和和底线处切底线处切线缝宽线缝宽的的公式公式代入分离度的公式得：代入分离度的公式得： 对于两个相邻的洗脱组分，假定对于两个相邻的洗脱组分，假定洗脱缝宽洗脱缝宽和和分配系分配系数近似相等数近似相等，即，即W1=W2，m1=m2，上式简化：上式简化： 将将塔板数塔板数的公式代入得：的公式代入得：22将容

10、量因子的公式代入得：将容量因子的公式代入得：分离度随着理论塔板数的增大而增大分离度随着理论塔板数的增大而增大，当两种溶质的当两种溶质的分配系数（容量因子）相差较小时分配系数（容量因子）相差较小时，需要较多的理论需要较多的理论板数板数才能获得较大的分离度。才能获得较大的分离度。23 凝胶过滤层析凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography，GFC）1. 1. 原理与操作原理与操作用用凝胶粒子凝胶粒子为固定相，根据料液中溶质为固定相，根据料液中溶质相对分子质量相对分子质量的的差别差别进行分离的液相层析法。进行分离的液相层析法。2425 26 基本概念基本概念洗脱体积洗脱

11、体积 27GFC的洗脱曲线的洗脱曲线28洗脱体积洗脱体积（V Ve e）是指将样品中某一组分洗脱下来所是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。需洗脱液的体积。它包括自它包括自加入样品加入样品时算起，到组时算起，到组分分最大浓度出现最大浓度出现时所流出的体积。时所流出的体积。 V Ve e一般是介于一般是介于V Vo o 和和之间的。之间的。 对于对于完全排阻完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其洗脱体积：故其洗脱体积： V Ve e V Vo o 对于对于完全渗透完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其

12、洗脱体积：个体积内，故其洗脱体积： V Ve e 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。于二者之间。29洗脱体积的测定？洗脱体积的测定？可以通过测定可以通过测定完全排阻完全排阻的大分子物的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用质的洗脱体积来测定，一般常用作作为为测定测定。可以通过测定可以通过测定的小分子溶的小分子溶质质的洗脱体积来测定的洗脱体积来测定 即即 V Ve eV Vo oV Vi i 推出推出 V Vi i V Ve e V Vo o可用下式计算：可用下式计算： VtVt（D/2D/2）2 2h h 2 2）根据）根据 Vt

13、VtV Vo oV Vi i V Vs s 可以得到可以得到 3 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积水的体积。30对某物质在凝胶柱内洗脱体积对某物质在凝胶柱内洗脱体积VeVe、V Vo o和和ViVi之间的关之间的关系可用下式表示：系可用下式表示： VeVomVi m m为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的定的分配系数分配系数。m m可通过实验由可通过实验由VeVe、VoVo和和ViVi求得。求得。V V0 0 VomVi VVt t 推出推出0m0m1 1，所以，所以GFCGF

14、C的分离的分离精度有限。精度有限。 对于对于的大分子的大分子 V Ve e V Vo o 故故 对于对于的小分子的小分子 V Ve e V Vt t 故故 m m 1 1mVeV0Vi31 但实际上，约有但实际上，约有1/51/5的内水因溶剂化作用而呈水合的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上VeVe小分子小分子 VoVo0.8Vi0.8Vi；当当0 0m ml l时时，意味着溶质分子只有，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散部分向凝胶颗粒内扩散，m m愈大，进入凝胶颗粒内愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；的程度愈大；m m0.50.

15、5时，其洗脱体积时，其洗脱体积VeVeVoVo十十0.5Vi0.5Vi。 GFCGFC中溶质的分配系数中溶质的分配系数m m只是只是相对分子质量相对分子质量、分子形分子形状状、和、和凝胶结构凝胶结构的函数，与洗脱液的的函数，与洗脱液的pHpH和和离子强度离子强度等物性等物性无关无关，即在一般的层析操作条件下，即在一般的层析操作条件下，相对分相对分子质量一定的溶质的分配系数为一常数子质量一定的溶质的分配系数为一常数。GFCGFC一般一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱即采用组成一定的洗脱液进行洗脱即恒定洗脱法恒定洗脱法。 322.凝胶过滤介质凝胶过滤介质良好凝胶过滤介质的要求：良好凝胶过滤介质的要求

16、：亲水性高、表面惰性（不存在相互作用）；亲水性高、表面惰性（不存在相互作用）；稳定性强，在较宽的稳定性强，在较宽的pHpH范围及化学试剂中保持稳定；范围及化学试剂中保持稳定；具有一定的孔径分布范围；具有一定的孔径分布范围；机械强度高，允许较高的操作压力；机械强度高，允许较高的操作压力；常用的凝胶介质常用的凝胶介质33名称名称基质基质制造商制造商Sephadex G(10-200)Sephadex G(10-200)交联葡聚糖交联葡聚糖PharmaciaPharmaciaSepharose 2BSepharose 2B、4B4B、6B6B琼脂糖琼脂糖PharmaciaPharmaciaSepha

17、rose CL 4BSepharose CL 4B、6B 6B 交联琼脂糖交联琼脂糖PharmaciaPharmaciaSephacryl S Sephacryl S 系列系列聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺- -葡聚糖葡聚糖PharmaciaPharmaciaSuperdex Superdex 系列系列高交联琼脂糖高交联琼脂糖- -葡聚糖葡聚糖PharmaciaPharmaciaSuperose Superose 系列系列高交联琼脂糖（二次交联）高交联琼脂糖（二次交联）PharmaciaPharmaciaBio-Beads S-XBio-Beads S-X系列系列苯乙烯苯乙烯- -二乙烯苯二乙烯苯Bio

18、RadBioRadBio-GelP Bio-GelP 系列系列聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺BioRadBioRadBio-GelA Bio-GelA 系列系列琼脂糖琼脂糖BioRadBioRadTSKgel SW TSKgel SW 系列系列硅胶硅胶ToyoSodaToyoSodaTSKgel Toyopearl HW TSKgel Toyopearl HW 系系列列亲水性聚乙烯醇亲水性聚乙烯醇ToyoSodaToyoSodaTSKgel PW TSKgel PW 系列系列亲水性聚乙烯亲水性聚乙烯ToyoSodaToyoSodaTSKgel CW-35 TSKgel CW-35 系列系列纤维素纤维素T

19、oyoSodaToyoSodaCellulofineCellulofine纤维素纤维素ChissoChisso机械强度高半刚性凝胶，中压液相层析用高压液相层析用两者均具刚性结构34 凝胶的特性参数凝胶的特性参数排阻极限排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。如：相对分子质量。如：Sephadex G50的排阻极限为的排阻极限为30KD。分级范围分级范围：能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分：能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。离的溶质的相对分子质量范围。 Sephadex G50：1.530KD。溶胀率溶胀率：每克干凝

20、胶所吸收的水分的百分数。：每克干凝胶所吸收的水分的百分数。 溶胀率溶胀率=100%（溶胀处理平衡后的重量）（溶胀处理平衡后的重量）/干燥重量干燥重量床体积床体积：1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。凝胶的床干燥凝胶溶胀后所占的体积。凝胶的床体积可用于体积可用于估算估算装满一定体积的层析柱所需要的装满一定体积的层析柱所需要的干干凝胶量凝胶量。凝胶粒径凝胶粒径：多用筛目或微米表示。：多用筛目或微米表示。35孔隙体积孔隙体积：层析柱中凝胶之间孔隙的体积，用：层析柱中凝胶之间孔隙的体积，用V0表表示。用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。示。用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。3.影响分离特性的因素影响分

21、离特性的因素 HETP影响溶质的分离度，影响影响溶质的分离度，影响HETP的因素：的因素：线速度：流动相在轴向上的流动速度。线速度：流动相在轴向上的流动速度。料液体积料液体积料液浓度料液浓度 根据分离原理来说，根据分离原理来说，溶质的洗脱时间溶质的洗脱时间tR和和HETP与料与料液的浓度无关。液的浓度无关。实际操作中发现，当料实际操作中发现，当料液浓度较高液浓度较高时，洗脱曲线不对称，出现时，洗脱曲线不对称，出现吐舌吐舌和和拖尾拖尾，甚至出现，甚至出现分裂的两个峰分裂的两个峰，原因使料液和流动相的，原因使料液和流动相的粘度差粘度差引起引起的。经验表明料液和流动相的的。经验表明料液和流动相的粘度

22、比粘度比需要需要小于小于2。36排阻极限极小排阻极限很大分子扩散引起急速下降37 用无因此进料时间表示料液体积38相对分子质量与分配系数的关系相对分子质量与分配系数的关系m m是判断是判断分离效果分离效果的一个重要参数，同时也是的一个重要参数，同时也是测定蛋测定蛋白质分子质量白质分子质量的一个依据。的一个依据。对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的各个组分的m m与其与其分子质量的对数分子质量的对数成成线性线性关系：关系： m m b blgMr+lgMr+c c 由于由于V Ve e 和和m m也成线性关系所以同样有：也成线性关系所

23、以同样有： V Ve e b blglgM Mr+r+c c通过将一些已知分子质量的通过将一些已知分子质量的标准蛋白质标准蛋白质在同一凝胶在同一凝胶柱上以柱上以相同条件相同条件进行进行洗脱洗脱，分别测定，分别测定V Ve e 或或m m，并根据并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后上述的线性关系绘出标准曲线，然后V Ve e 或或m m，通过标准曲线即可求出其分通过标准曲线即可求出其分子质量。子质量。39凝胶粒径凝胶粒径 通过通过减小粒径减小粒径，不仅可以，不仅可以降低降低HETP，还可以，还可以提高提高分离速度分离速度。4.GFC4.GFC的应用、特点的应用、特点生物大分子的纯化生物大分子的

24、纯化分子量测定分子量测定脱盐及去除小分子杂质脱盐及去除小分子杂质去热源物质去热源物质 溶液的浓缩溶液的浓缩40A. 凝胶层析凝胶层析操作简便操作简便，所需，所需设备简单设备简单。有时只要。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质有一根层析柱便可进行工作。分离介质凝胶凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生再生过程过程便可重复使用。便可重复使用。B.B. 分离分离效果较好效果较好，重复性高。最突出的是样品，重复性高。最突出的是样品回回收率高收率高，接近，接近100100。C. 分离条件分离条件缓和缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化

25、学键的变化，所以对分离物的活性没有涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。不良影响。D.D. 应用广泛应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很分离的分子量范围也很宽宽，如，如Sephadex GSephadex G类为类为10102 210105 5d d；SepharoseSepharose类类为为10105 510108 8d d。41离子交换层析离子交换层析 利用利用离子交换剂离子交换剂为固定相，根据荷电溶质

26、与离子交为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间的换剂之间的静电相互作用力的差别静电相互作用力的差别进行溶质分离的进行溶质分离的洗脱层析方法。洗脱层析方法。1.原理与操作原理与操作 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式：荷电溶质在离子交换剂上的分配系数可用下式： I 为流动相的离子强度，为流动相的离子强度，A和和B为常数，为常数，m为离子强为离子强度无限大时溶质的分配系数度无限大时溶质的分配系数，是，是静电相互作用以为静电相互作用以为的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配的非特异性吸附引起的溶质在离子交换剂上的分配。42 蛋白质的蛋白质的分配系数对离子强度非常敏感分配系数对离子强度非常

27、敏感，即离子强，即离子强度的微小变化，会引起分配系数的很大变化。度的微小变化，会引起分配系数的很大变化。 同一离子强度下不同的蛋白质的分配系数可能相差同一离子强度下不同的蛋白质的分配系数可能相差很大很大。如果采用离子强度不变的流动相进行洗脱，。如果采用离子强度不变的流动相进行洗脱，两种蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大两种蛋白质的洗脱体积相差很大，甚至分配系数大的蛋白质很难得到洗脱，造成的蛋白质很难得到洗脱，造成洗脱剂的大量消耗和洗脱剂的大量消耗和洗脱时间的大幅度增加洗脱时间的大幅度增加。所以，。所以，IECIEC很少采用恒定洗很少采用恒定洗脱，多采用流动相离子强度线性增大的脱，多采用流

28、动相离子强度线性增大的线性梯度洗线性梯度洗脱法脱法和离子强度阶段改变的和离子强度阶段改变的逐次洗脱法逐次洗脱法。 线性洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，溶线性洗脱过程中，流动相的离子强度线性增大，溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大。线性质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大。线性洗脱可通过洗脱可通过改变离子强度的增大速度改变离子强度的增大速度（浓度梯度），（浓度梯度），调整溶质的洗脱体积调整溶质的洗脱体积，即溶质洗脱峰间的距离即溶质洗脱峰间的距离，改改变分离度的同时缩短洗脱时间变分离度的同时缩短洗脱时间。43洗脱体积相差很大，消耗大量的洗脱液及洗脱时间44 45逐次洗脱过程逐次洗脱过

29、程，流动相的，流动相的离子强度阶段性增大离子强度阶段性增大，溶，溶质质分配系数的降低分配系数的降低和和移动速度的增大移动速度的增大也是也是阶段性阶段性。如果流动相的阶跃速度很快，在每种离子强度下的如果流动相的阶跃速度很快，在每种离子强度下的洗脱时间都很短，逐次洗脱接近线性梯度洗脱，反洗脱时间都很短，逐次洗脱接近线性梯度洗脱，反之接近恒定洗脱。之接近恒定洗脱。逐次洗脱介于恒定洗脱和线性洗逐次洗脱介于恒定洗脱和线性洗脱之间。脱之间。线性洗脱法线性洗脱法 优点：流动相离子强度连续增大，优点：流动相离子强度连续增大，不出现干扰峰不出现干扰峰，操作范围广。操作范围广。 缺点：需要特殊缺点：需要特殊设备调

30、配浓度梯度设备调配浓度梯度。逐次洗脱法逐次洗脱法 优点：切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，优点：切换不同盐浓度的流动相溶液进行洗脱，不不许特殊设备，操作简单许特殊设备，操作简单 缺点：流动相不连续变化，缺点：流动相不连续变化，容易出现干扰峰容易出现干扰峰。46 线性洗脱过程线性洗脱过程线性洗脱条件下，线性洗脱条件下，IEC柱内溶质区带的柱内溶质区带的后部移动速度后部移动速度高于前部高于前部，即线性洗脱具有，即线性洗脱具有区带浓缩区带浓缩作用。作用。由于由于轴向返混轴向返混和和传质阻力传质阻力的影响，溶质区带在洗脱的影响，溶质区带在洗脱过程中不短的过程中不短的分散分散。区带浓缩作用和分散作用达

31、到一平衡时，区带浓缩作用和分散作用达到一平衡时，区带将以区带将以一定的宽度向下移动一定的宽度向下移动，即达到，即达到准稳态准稳态。影响分离度的因素影响分离度的因素 当离子强度梯度当离子强度梯度I I/ V一定时，一定时，分离度与柱高无分离度与柱高无关关。柱高一定时分离度随离子强度梯度的降低而增柱高一定时分离度随离子强度梯度的降低而增大大。 分离度与分离度与介质粒径成反比介质粒径成反比，与，与流速的平方根成反比流速的平方根成反比。47 料液量对分离料液量对分离度的影响度的影响利用利用浓缩料液浓缩料液有利于在不影有利于在不影响分离度的前响分离度的前提下提高提下提高IEC柱柱的处理能力的处理能力。（

32、7.5mg蛋白） （3.75mg蛋白）48逐次洗脱过程逐次洗脱过程 如果如果盐浓度的阶跃合理盐浓度的阶跃合理，可以，可以使目标溶质得到高度使目标溶质得到高度浓缩浓缩。不合理，盐浓度太高，会使许多溶质同时洗。不合理，盐浓度太高，会使许多溶质同时洗脱，造成分离失败。脱，造成分离失败。 A吸附B完全脱附相当于梯度非常大的线性梯度浓缩，溶质高度浓缩相当于恒定洗脱，区带宽度增大。49IECIEC的应用及特点的应用及特点 GFCGFC主要用于生物产物的初步纯化和中后期的脱盐，主要用于生物产物的初步纯化和中后期的脱盐，IECIEC则是蛋白质、肽、核酸等生物产物的主要纯化则是蛋白质、肽、核酸等生物产物的主要纯

33、化手段手段。 料液处理量大，具有浓缩作用，可以在较高的流速料液处理量大，具有浓缩作用，可以在较高的流速下操作；下操作； 应用范围广，优化操作条件可大幅度的提高分离的应用范围广，优化操作条件可大幅度的提高分离的选择性，所需柱长较短；选择性，所需柱长较短； 产品回收率高；产品回收率高； 商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格远商品化的离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂。低于亲和吸附剂。 IECIEC的操作变量远多用的操作变量远多用GFCGFC，影响分离特性的因素非，影响分离特性的因素非常的复杂，增加了常的复杂，增加了过程设计和规模放大过程设计和规模放大的的难度难度。小。小型层析

34、柱的实验数据一般不能用于规模放大。型层析柱的实验数据一般不能用于规模放大。50聚焦层析聚焦层析(focusing chromatography) 利用两性电解质分子间利用两性电解质分子间等电点的不同等电点的不同进行分离纯化进行分离纯化的的洗脱层析方法洗脱层析方法。利用在较宽。利用在较宽pH范围内具有缓冲作范围内具有缓冲作用的用的多缓冲离子交换剂多缓冲离子交换剂为固定相，同时，利用在较为固定相，同时，利用在较宽宽pH范围内具有缓冲作用的范围内具有缓冲作用的多缓冲剂多缓冲剂做流动相。当做流动相。当在层析柱内通入与柱内初始在层析柱内通入与柱内初始pH不同的多缓冲剂时，不同的多缓冲剂时，柱内柱内pH缓

35、慢改变，在缓慢改变，在轴向形成连续的轴向形成连续的pH梯度梯度，使料，使料液中的溶质依据各自的等电点或者吸附，或者洗脱，液中的溶质依据各自的等电点或者吸附，或者洗脱，逐次向下移动，彼此间得到分离，该方法称之为逐次向下移动，彼此间得到分离，该方法称之为聚聚焦层析焦层析。 51 层析聚焦过程示意图层析聚焦过程示意图柱内pH为pH0用pHe的多缓存液洗脱52 由于溶质区带由于溶质区带后部的后部的pH总是总是低于前部低于前部，所以区带后，所以区带后部总是先于前部移动，区带部总是先于前部移动，区带受到压缩受到压缩，因此，层析，因此，层析聚焦有聚焦有浓缩溶质浓缩溶质的作用。的作用。多缓冲剂和多离子交换剂多

36、缓冲剂和多离子交换剂 多缓冲剂是多缓冲剂是两性电解质缓冲剂两性电解质缓冲剂，由相对分子质量大，由相对分子质量大小不一的各种组分构成，每种构成成分均为小不一的各种组分构成，每种构成成分均为多羧基多羧基和和多氨基多氨基化合物，存在各自的等电点。化合物，存在各自的等电点。 Pollybuffer 96 pH 96 Pollybuffer 74 pH7 4 Pharmalyte pH10.5 8 53 多缓冲离子交换剂多缓冲离子交换剂可用普通的可用普通的凝胶凝胶过滤介质偶联过滤介质偶联特殊的特殊的离子交换基离子交换基制备。制备。 PBE118、94是以是以Sepharose 6B为载体阴离子为载体阴离

37、子交换剂。交换剂。 PBE118 配配 Pharmalyte PBE 94 配配 Pollybuffer 96、 Pollybuffer 74 Mono P是一种弱碱性的阳离子交换剂，可与上是一种弱碱性的阳离子交换剂，可与上述三种缓冲液相配。述三种缓冲液相配。 层析聚焦的应用层析聚焦的应用 生化生化实验室规模实验室规模的样品制备或成分分析。的样品制备或成分分析。54疏水作用层析疏水作用层析(hydrophobic chromatography)利用固定相利用固定相载体载体上偶联的上偶联的疏水性配基疏水性配基与流动相中的与流动相中的一些一些疏水分子疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，发生可逆

38、性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。称之为疏水层析。疏水性吸附剂疏水性吸附剂 各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基。常用的疏水各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基。常用的疏水性配基主要有性配基主要有苯基苯基、短链烷基短链烷基（C C3 3C C8 8）、）、烷氨基烷氨基、聚乙二醇聚乙二醇、聚醚聚醚等。等。55 R代表疏水配基代表疏水配基 56 影响疏水性吸附的因素影响疏水性吸附的因素 离子强度及种类。离子强度及种类。 蛋白质的疏水作用蛋白质的疏水作用随离子强度的提高而增大随离子强度的提高而增大，高价离子对疏水作用的影响强高价离子对疏水作用的影响强。 破坏疏水作用的物质破坏疏水作用的物质 SCN-，

39、ClO4-和和I-等离子半径较大、电荷密度低等离子半径较大、电荷密度低的阴离子可的阴离子可减弱水分子间的相互作用减弱水分子间的相互作用。 表面活性剂表面活性剂 减弱减弱蛋白质的蛋白质的疏水性疏水性。 温度温度 吸附结合作用吸附结合作用随温度的升高而增大随温度的升高而增大。57HIC的特点的特点由于高浓度盐溶液中疏水吸附作用增大，可由于高浓度盐溶液中疏水吸附作用增大，可直接分离盐析后的蛋白溶液直接分离盐析后的蛋白溶液。可通过调节可通过调节疏水配基链长和密度调节疏水配基链长和密度调节吸附力，吸附力，可根据目标产物的特性选择适宜的吸附剂。可根据目标产物的特性选择适宜的吸附剂。疏水性吸附剂疏水性吸附剂

40、种类多种类多，选择余地大，价格与，选择余地大，价格与离子交换剂相当。离子交换剂相当。58反向层析反向层析(reverse phase chromatography(reverse phase chromatography，RPC)RPC) 利用利用非极性非极性的的反相介质反相介质为固定相，为固定相，极性有机溶剂的极性有机溶剂的水溶液水溶液为流动相，根据溶质的为流动相，根据溶质的极性（疏水性）的差极性（疏水性）的差别别进行溶质分离纯化的洗脱层析法，称之为进行溶质分离纯化的洗脱层析法，称之为反相层反相层析。析。 RPC中溶质通过疏水性相互作用分配于固定相，但中溶质通过疏水性相互作用分配于固定相，但

41、RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强，表现强烈的疏水性。因此，必须采用烈的疏水性。因此，必须采用极性有机溶剂极性有机溶剂（甲醇、甲醇、乙腈）乙腈）或或其水溶液其水溶液进行溶质的洗脱分离。进行溶质的洗脱分离。 RPC主要应用于主要应用于相对分子质量低于相对分子质量低于5000，特别是，特别是1000以下的非极性小分子以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。59溶质在反相介质上的溶质在反相介质上的分配系数分配系数取决于取决于溶质溶质的的疏水性疏水性。一般疏水性越大

42、，分配系数越大。一般疏水性越大，分配系数越大。RPC多采用多采用降低流动相极性的（含水量）的线性梯降低流动相极性的（含水量）的线性梯度洗脱法度洗脱法。 反相介质反相介质 以以硅胶硅胶为载体，通过为载体，通过硅烷化硅烷化反应在硅胶的表面反应在硅胶的表面键合键合非极性分子层非极性分子层制备。制备。 R1和和R2多为甲基，多为甲基，R为为C4、C8、C18烷基或苯基烷基或苯基。其中。其中利用利用C18硅烷化制备的反相介质最多，通称硅烷化制备的反相介质最多，通称ODS。60 高分子聚合物高分子聚合物也可作为反相介质的载体也可作为反相介质的载体 TSK gel Octadecy1-4PW TSK gel

43、 Octadecy1-NPR（聚丙烯酸酯（聚丙烯酸酯C18） 反相介质反相介质性能稳定性能稳定，分离效率高分离效率高，可分离蛋白质、，可分离蛋白质、肽、氨基酸、核酸、甾类脂类、脂肪酸、糖类、肽、氨基酸、核酸、甾类脂类、脂肪酸、糖类、植物碱。植物碱。RPC作为作为定量分析手段定量分析手段，广泛应用于，广泛应用于科科学研究学研究、临床诊断临床诊断、工业检测工业检测、环保环保等各行业。等各行业。作为作为产品纯化制备产品纯化制备手段，由于反相介质与其分离手段，由于反相介质与其分离的对象比的对象比价格较高价格较高，多限于，多限于实验室规模实验室规模的应用。的应用。61羟基磷灰石层析羟基磷灰石层析（hyd

44、roxyapatite, HAP） 羟基磷灰石是一种羟基磷灰石是一种磷酸钙晶体磷酸钙晶体，基本分子结构，基本分子结构 Ca10(PO4)6(OH)2。HAP的表面存在两种不同的吸附的表面存在两种不同的吸附晶面，各存在晶面，各存在吸附点吸附点C点和点和P点点，前者起阴离子交前者起阴离子交换作用换作用，后者起阳离子交换作用后者起阳离子交换作用。当在。当在中性环境中性环境下，下，酸性蛋白质主要吸附于酸性蛋白质主要吸附于C点点，碱性蛋白主要吸附于碱性蛋白主要吸附于P点点，利用，利用磷酸缓冲液磷酸缓冲液（K2HPO4和和KH2PO4）为流）为流动相动相洗脱展开洗脱展开时，磷酸根离子在时，磷酸根离子在C点

45、竞争性吸附，点竞争性吸附，交换出酸性蛋白；交换出酸性蛋白；K+在在P点竞争吸附，交换出碱性点竞争吸附，交换出碱性蛋白质。所以，蛋白质。所以，HAP层析通常层析通常以磷酸盐缓存液为流以磷酸盐缓存液为流动相，采用提高盐浓度的线性洗脱法动相，采用提高盐浓度的线性洗脱法。62 HAP晶体可用于晶体可用于识别识别DNA和和RNA的单链和双链的单链和双链，分离分离IEC和和HIC难于分离的蛋白质物系，难于分离的蛋白质物系，分辨率更分辨率更高高。如：人肿瘤坏死因子，用。如：人肿瘤坏死因子，用IEC法、高效法、高效RPC法和电泳法只得到一个洗脱峰，而用法和电泳法只得到一个洗脱峰，而用HAP层析可层析可得到四个

46、洗脱峰。得到四个洗脱峰。 HAP吸附剂吸附剂价格便宜价格便宜，远低于离子交换剂，适用，远低于离子交换剂，适用于于大规模的分离纯化过程大规模的分离纯化过程，已经成为，已经成为纯化单克隆纯化单克隆抗体的主要手段抗体的主要手段。63灌注层析灌注层析(perfusion chromatography) 灌柱层析是美国灌柱层析是美国Perseptive Biosystems公司开发公司开发的层析分离技术。灌柱层析的关键是以的层析分离技术。灌柱层析的关键是以POROS命命名的名的固定相粒子的特殊结构固定相粒子的特殊结构：基质是聚苯乙烯：基质是聚苯乙烯-二二乙烯苯，含有乙烯苯，含有两种大小不同的孔道两种大小

47、不同的孔道。大孔径的直径。大孔径的直径为为0.6-0.8m0.6-0.8m，流体以，流体以对流对流形式通过，称为形式通过，称为穿透孔穿透孔。小孔径与一般介质一样，流体扩散的形式通过，称小孔径与一般介质一样，流体扩散的形式通过，称为为扩散孔扩散孔。穿透孔之间以扩散孔相连。穿透孔之间以扩散孔相连。64 灌柱层析的灌柱层析的流速一般较高流速一般较高，500-5000cm/h，在此，在此范围内，范围内，HETP仅是仅是粒径粒径的函数与流速无关，所以的函数与流速无关，所以高流速下操作不影响柱效高流速下操作不影响柱效。超过上述范围，。超过上述范围，HETP随流速的增大而增大随流速的增大而增大。 灌柱层析最大的特点是灌柱层析最大的特点是分离速度快分离速度快。65超临界流体层析超临界流体层析6667亲和纯化亲和纯化 生物亲和作用生物亲和作用：生物分子能够：生物分子能够区分结构区分结构和和性质性质非非常相近的其他分子，选择性的与其中某一种分子常相近的其他分子，选择性的与其中某一种分子结合，生物分子的这种特异性相互作用，具有排结合，生物分子的这种特异性相互作用，具有排他性。他性。 亲和纯化技术亲和纯化技术：利用生物分子间的特异性结合作：利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术。用的原理进行生物物质分离纯化的技术。 亲和作用不只限于生物物质之间，亲和作用不只限于生物