第2章生物样品前处理

1、赵 世 光现代生化分离技术现代生化分离技术Separation Methods in Biochemistry Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering2第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Bioche

2、mical Engineering3第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理第一节 样品分离的预提取第二节 细胞的破碎与分离 第一章 绪论Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering4第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理第一节 样品分离的预提取（前处理） 前处理的目的：对目标组分进行初步富集，前处理的目的：对目标组分进行初步富集，对干扰成分对干扰成分进行去除；进行去除； 2.1.1 2.1.1 概述概述预处理材料的

3、种类和特点预处理材料的种类和特点 动物细胞反应液动物细胞反应液植物细胞反应液植物细胞反应液微生物细胞反应液微生物细胞反应液植物组织提取液植物组织提取液动物组织提取液动物组织提取液“发酵液发酵液” “” “产物产物”，胞内，胞内oror胞外？胞外？组织组织Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering5第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理2.1.2 2.1.2 植物组织提取物的制备植物组织提取物的制备Anhui Univ

4、ersity of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering6第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞提取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌破坏后，彼此

5、接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。 2.1.2.1 2.1.2.1 植物组织中酶的提取植物组织中酶的提取Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering7第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理例子：植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取例子：植物组织中二磷酸

6、核酮糖碳酸酶的提取1. 步骤：步骤：100g100g新鲜叶片新鲜叶片切成小片（打孔器、切片）切成小片（打孔器、切片）置入提取置入提取液中（稳定酶活性）液中（稳定酶活性）PVPPPVPP预浸泡（预浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性酮，可溶性PVPPVP聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮，），）间歇高速搅拌（充分接间歇高速搅拌（充分接触混匀）触混匀）纱布过滤纱布过滤滤液加入滤液加入PVPPPVPP重复轻搅（重复一重复轻搅（重复一次）次）离心去除离心去除PVPPPVPP酶粗提液。酶粗提液。Anhui University of Technology and ScienceTeachi

7、ng and Research Section Department of Biochemical Engineering8第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理2. 条件讨论条件讨论低温（低温（45度），器皿、溶液预冷、操作要快；度），器皿、溶液预冷、操作要快；57倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不利于酶活稳定）；利于酶活稳定）；PH6.57.0，中性，未知蛋白酶要远离等电点；，中性，未知蛋白酶要远离等电点；PVPP优良，不溶性；优良，不溶性；PPO抑制剂，抑制剂，DTT、2-ME；蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶

8、解，剧毒。（苯甲磺酰氟）酒精溶解，剧毒。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering9第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理2.1.2.2 2.1.2.2 多糖提取多糖提取重要活性多糖重要活性多糖步骤：原料步骤：原料粉碎粉碎醇醚回流脱脂醇醚回流脱脂水提取水提取粗提液粗提液去蛋白策略：去蛋白策略：SevagSevag法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性性TCATCA法，低浓度的法，低浓度的TCA

9、TCA可沉淀蛋白质，离心后即可除去可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。蛋白质。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering10第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理2.1.2.3 2.1.2.3 细菌重组蛋白的提取细菌重组蛋白的提取重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，40%40%总蛋总蛋白含量，但易形成包涵体（蛋白质以不溶形式包涵在细白含量，但易形成包涵体（蛋白质以不溶形

10、式包涵在细胞质中）。胞质中）。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering11第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理例：例：E. coli.E. coli.中提取重组蛋白中提取重组蛋白1. 步骤：步骤：酶解菌体细胞：离心收集菌体酶解菌体细胞：离心收集菌体溶菌酶溶菌酶去核酸（去核酸（DNaseDNase）电泳检测；电泳检测；清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶解；解；溶

11、解包涵体：释放目的蛋白；溶解包涵体：释放目的蛋白；目的蛋白再折叠：恢复活性目的蛋白再折叠：恢复活性Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering12第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理第二节 细胞的破碎与分离微生物代谢产物：微生物代谢产物：胞外产物（氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等）胞外产物（氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等）胞内产物（大多数蛋白质、类脂）胞内产物（大多数蛋白质、类脂）微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但

12、有些目标产物微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。目前重组存在细胞内部。目前重组DNADNA技术，表达的产品（如胰技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。取。 2.2.1 概述概述Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering13第二章

13、第二章 生物样品前处理生物样品前处理2.2.2 2.2.2 常用破碎方法常用破碎方法机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-pressX-press法等；对物料的挤压和剪切作用法等；对物料的挤压和剪切作用非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等；非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等；Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering14第二章第二章 生物样品前处理生

14、物样品前处理2.2.2.1 2.2.2.1 珠磨法珠磨法原理：原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、石英砂、氧化铝石英砂、氧化铝d1mmdG+G-G+酵母。酵母。易失活物质不宜用（超声波可促使产生一些化学自由，易失活物质不宜用（超声波可促使产生一些化学自由，基因使敏感活性物质失活），可加入保护剂基因使敏感活性物质失活），可加入保护剂N2N2、PMSFPMSF等等 特点：特点：Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Departm

15、ent of Biochemical Engineering20第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理溶菌酶（细菌），溶菌酶（细菌），-3-3，3-3-葡聚糖酶，葡聚糖酶，-1-1，6-6-葡聚糖酶，葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽键内切酶，壳多糖酶，细胞蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽键内切酶，壳多糖酶，细胞壁溶解酶（复合酶），酵母。酶有专一性。壁溶解酶（复合酶），酵母。酶有专一性。特点：特点：条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物（可从细胞不同条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物（可从细胞不同位置）位置）价格高，限制了大规模应用价格高，限制了大规模应用通用性差，不同菌种需选择不同的

16、酶，最佳条件不易确定；通用性差，不同菌种需选择不同的酶，最佳条件不易确定；产物抑制的存在：在溶酶系统中，甘露糖产物抑制的存在：在溶酶系统中，甘露糖蛋白酶，葡聚糖蛋白酶，葡聚糖葡聚糖酶葡聚糖酶2.2.2.4 2.2.2.4 酶溶法酶溶法外加酶外加酶Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering21第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理将新鲜的生物材料存放于一定的将新鲜的生物材料存放于一定的pHpH和适当的温度下和适当的温度

17、下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。出来。特点：特点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质变性。对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质变性。自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。自溶法自溶法Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering22

18、第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理2.2.2.5 2.2.2.5 化学渗透法化学渗透法原理：原理：使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来透性）的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。，称为化学渗透法。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering23第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理表面活性物质：促使细胞某些组分

19、溶解，其增溶作表面活性物质：促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞破碎用有助于细胞破碎EDTAEDTA螯合剂：与结构中螯合剂：与结构中ca2+ca2+或或Mg2+Mg2+螯合，使其原有螯合，使其原有结构破坏而破裂结构破坏而破裂有机溶剂：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高级醇等，有机溶剂：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高级醇等，能被细胞壁中的类脂吸收，使胞壁膜溶胀，导致细能被细胞壁中的类脂吸收，使胞壁膜溶胀，导致细胞破碎；胞破碎；变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水性化合物溶于水Anhui University of Technology

20、and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering24第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理特点特点选择性释放产物。可使一些较小分子量的溶质，如多肽选择性释放产物。可使一些较小分子量的溶质，如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。在胞内。细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。离和进一步提取。通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞；通用

21、性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞；时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过80%80%；有些化学试剂有毒，在其后产物提取精时，需分离除去有些化学试剂有毒，在其后产物提取精时，需分离除去。Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemical Engineering25第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁

22、作用。由于冷冻，一方面使细反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。性。 2.2.2.6 2.2.2.6 反复冻结反复冻结融化法融化法原理：原理：Anhui University of Technology and ScienceTeaching

23、 and Research Section Department of Biochemical Engineering26第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。，胞内物质就容易被抽提出来。热空气干燥、真空干燥、冷冻干燥热空气干燥、真空干燥、冷冻干燥2.2.2.72.2.2.7干燥法干燥法Anhui University of Technology and ScienceTeaching a

24、nd Research Section Department of Biochemical Engineering27第二章第二章 生物样品前处理生物样品前处理X-pressX-press法：将浓缩的菌体悬浮液冷却至法：将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25-25形成形成冰晶体，利用冰晶体，利用500MPa500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。生化物质。 2.2.2.8 2.2.2.8 其他方法其他方法Anhui University of Technology and ScienceTeaching and Research Section Department of Biochemica