雌激素对紫外线作用下人永生化角质形成细胞的保护作用

1、作者：仇金鹏 李澄 任明胡玉琳 佟倜 王艳【摘要】目的 探讨雌二醇(17be2)对中波紫外线(uvb)照射下人永牛化角质形成细胞(hacat细胞)的保护作用。方法 将体外培养的hacat细胞随机分为3组：正常组、uvb组、e2组，分别 加入不同的处理因素，uvb组在uvb灯下照射6 min后继续培养，e2组 照射前预先给予17 be2使其终浓度达107 mol/l,正常组不加处理因素；照射结束后继续培养12 h后收集细胞，测定各组细胞的超氧 化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)水平以及细胞内钙离子浓度和细胞 线粒体膜电位的变化。结果 与正常组比较，uvb组和e2组细胞线粒体 膜电位显箸降低(

2、p<0. 05),细胞内钙离子浓度显箸升高(p<0. 05), sod 水平显箸降低(p<0. 05), mda水平显著升高(p<0. 05)；与uvb组相比 较，e2组细胞线粒体膜电位显著升高(p<0. 05),细胞内钙离子浓度差 别不显著(p0. 05), sod水平显著升高(p0. 05), mda水平显著降低 (p<0. 05) o结论170e2可通过抗氧化和抗凋亡作用拮抗uvb引起的hacat细胞损伤，对uvb照射下的hacat细胞具有保护作用。【关键词】17p 雌二醇；hacat细胞；中波紫外线(uvb)接触过多的紫外线可以使人类的皮肤癌、白内障

3、等疾病的发病率升 高。紫外线可以通过损伤皮肤细胞dma,诱发自由基和细胞因子/炎症 趋化因子的产生，产生脂质过氧化损伤对皮肤造成光损伤导致皮肤衰老 其至引发皮肤癌(13。雌激素作为一种當体类激素，可以通过影响 皮肤厚度、湿度、弹性、血管供应、色素沉着來阻止皮肤老化，在抗皮 肤衰老方面，有其独到之处(4, 5，有研究表明雌激素可以抑制氧自 由基(ros)产生，减少氧化应激，具有一定的抗氧化和抗凋亡作用(6),然而对于雌激素对人角质形成细胞(hacat细胞)是否具有保护 作用，通过什么途径进行保护还知之甚少。因此，本实验预先用雌二醇(17be2)处理hacat细胞来观察其对中波紫外线(uvb)照射

4、导致细胞损伤的影响，探讨雌激素的作用机制，为研究皮肤光老化发生中17 b r2的作用提供实验依据。1材料与方法1.1 材料与仪器rpmi1640培养基、胰蛋口酶(gibco,美国)、台盼蓝(amresco,美国)、mda试剂盒(南京建成)、dmso (sigma,北京鼎 国分装，美国)、fac scan流式细胞仪(bection dickinson facscalibur,美国)、牛物显微镜(ch型，olympus,日木)、uvb灯(15w,上海顾村光电仪器厂)、fluo 3/am (biotium,美国)、罗丹明123 （sigma,美国）。1.2 方法1. 2. 1 细胞培养hacat细胞

5、在37°c、5%c02条件下培养于含10%标准胎牛血清 （fbs）的rpmt1640培养基中。当细胞融合至85%90%吋传代，弃掉 培养液，pbs冲洗2遍，用0.25%胰酶常规消化，用含血清的培养液迅 速终止消化，制成单细胞悬液。细胞计数，按ix 105接种于100価培 养皿中备用。1.2.2 分组及处理当培养皿内细胞融合达60%左右时，将细胞随机分为正常组、uvb 组、176 e2组。弃掉旧培养液，用高压灭菌的pbs冲洗3遍后，正 常组和uvb组加入含1%fbs的10 ml rpmt1640培养液，17 b e2组加 入 5 u1 0. 2 mmol/l 雌激素+含 1%fbs 的

6、0 ml rpmt1640 培养液，放 培养箱屮继续培养24 h后弃掉旧的培养液，用高压灭菌的pbs冲洗3 遍，向每个平皿内加入4 ml pbs,使之能浸没整个平皿底。uvb组和 17 b e2组打开平皿盖在15 w的uvb灯正下方照射6 min,正常组细 胞用锡纸盖住。照射后，立即弃掉平皿内pbs,加入4 ml 4°c预冷的 pbs冲洗3遍。之后加入rpmi1640培养液于培养箱继续培养12 h后收 获各组细胞备用。1.2.3 细胞内钙离子（ca2+ i）浓度测定将各组细胞常规消化后制成单细胞悬液，用pbs调整细胞讣数至 106个/ml。取含有5x105个细胞的悬液至1.5 ml微

7、量离心管屮；向 微量离心管中加入fluo 3/am ester （终浓度5 umol/l）,混匀； 在37°c孵箱中避光反应45 min后用pbs洗涤2次（1 500 r/min, 5 min）；在流式细胞仪（fcm）检测，检测条件为激发波长488 nm发 射波长530 miio1.2.4 细胞线粒体膜电位（屮m）测定各组细胞消化后制成单细胞悬液，用pbs调整细胞计数至106个 /mlo取含有5x105个细胞的上述细胞悬液至1.5 ml微量离心管中； 向微量离心管屮加入rhl23 （终浓度5 mg/l）,混匀；在37 °c孵箱屮 避光反应45 min后pbs洗涤细胞2次（1 500 r/min, 5 min）；在流 式细胞仪（fcm）检测，检测条件为激发波长488 nm发射波长530 nnio细胞中sod能清除超氧阴离子自由基(022),保护细胞免受损伤。受uvb照射后的细胞超氧阴离子自由基增高，细胞中sod对自由基 进行清除从而含量减少。022可氧化疑胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含有 sod吋，则对0