细胞生物学实验（吉林大学）使用流式细胞术检测化疗药物诱导的癌细胞凋亡

1、课程名称：开放性创新实验实验题目：使用流式细胞术检测化疗药物诱导的癌细胞凋广实验目的：1, 掌握细胞传代技术2, 了解流式细胞术在生命科学中的应用3, 掌握流式细胞仪的基本工作原理与操作4, 掌握annexin-v/pi双染测定细胞凋亡的原理5, 学会使用流式细胞仪用annexin-v/pi双染法测量细胞凋亡实验原理：细胞培养是将细胞从机体中取出，模拟机体内生理条件，在人工 条件下使其生存、生长和繁殖，进行细胞生命过程、细胞癌变等问题 的研究。传代培养则是指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开 接种到新的培养器皿中。流式细胞仪(flow cytometer)的工作原理是将待测细胞吸入到 被称

2、为鞘液的流动相中，并在鞘液的约束下形成单列细胞柱。通过光 学的方法对其中的细胞进行逐个检测。利用得到的散射光和荧光指标, 反应出细胞的体积、内部结构、dna或特定蛋白质等理化特征。生理条件下磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, ps)主要定位于 细胞膜内层，是一种细胞膜活性物质。当细胞发&凋亡时，ps会随 着细胞膜的外翻而暴露于细胞外，这是细胞凋亡早期的特征之一。 annexin-v是一种能与ps特意结合的磷脂结合蛋白。使用偶联上fitc 荧光基团的annexin-v可以准确方便的通过流式细胞仪检测细胞凋亡 的发生。碘化丙bg(propidine iodide, pi)

3、是一种无法透过完整细胞膜的 核酸染料，但在凋亡或死细胞中，pi能够透过细胞膜而与核酸结合 并发出特定荧光。因此将annexin-v与pi联合使用，就可以检测出 样品中活细胞、死细胞以及早晚期凋亡细胞所占的比例。所需仪器：细胞培养瓶等相关耗材、超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、离 心机、医用冰箱、200目过滤网、流式进样管、epics xl流式细胞仪、 muse细胞计数仪所需试剂：rpmi-1640培养基、hepes、胰酶、胎牛血清、70%酒精、pbs缓冲液(ph7.4)、annexin v-fitc/propidium iodide 凋亡双染试剂盒实验过程：1, 在rpmi-1640培养基中

4、缓慢滴加hepes调节ph值，到培养基颜 色变化，再加入10%胎牛血清，配置成完全培养基。2, 取处于对数生长期的hela细胞，移除培养基，加入pbs洗涤。3, 加入胰酶室温消化3分钟后加入等量完全培养基中和胰酶，再吹 打成单细胞悬液，转移至离心管中，1800 rpm,离心5 min,去 上清。4, 使用1 ml完全培养基重悬细胞沉淀，转移其中的0.5 ml至培养瓶 中培养两天。5, 取出细胞，显微镜下观察细胞状态并记录。6, 移除培养基，加入pbs洗涤。7, 重复步骤3。8, 使用1 ml pbs重悬沉淀后，1800 rpm,离心5 min。9, 去上清，细胞沉淀用50 pl凋亡检测试剂盒中

5、的结合缓冲液重悬， 然后加入annexin v-fitc 2 pl,室温避光孵育15 min再加入试剂盒 中的pi 4 pl,室温避光孵育5 min后加入450 pl结合缓冲液后， 过200冃的滤网于流式进样管中待测。10, 流式细胞仪上机。上机内容：1.观察流式细胞仪的操作界面：fsc,前向散射光；ssc,侧向散射 光；fl12,荧光通路12 （本次实验中，fl1对应fitc检测通路， fl2对应pi检测通路）；gate,门（包括多边形门和十字门）；volts/gain, 光电倍增值；event,收集的事件（本次实验对应hela细胞）。2调节fsc-ssc信号：调节fsc与ssc信号后面的v

6、olts/gain值， 使图中的细胞分布群尽量集中，且尽量靠近预设门的中间，使待 测细胞呈现单一的正态分布，去除碎片以及黏连的影响，降低实 验干扰。大体上，细胞的fsc和ssc信号值正比于volts/gain值。3调节荧光补偿：为去除荧光信号的相互干扰，首先检测fitc单染 的凋亡阳性细胞。通过调节fl2-fl1%值，使细胞全部出现在 fl1-fl2图中十字门的下方，且不要过于靠近x轴。然后检测pi 单染的凋亡阳性细胞，通过调节fl1-fl2%值，使细胞全部出现在 fl1-fl2图中十字门的左侧，且不要过于靠近y轴，在随后的测 试中，保持这两个数值不变。4调节fl1-fl2信号：通过调节fl1和fl2信号后面的volts值，使阴性对照的绝大部分细胞出现在十字门的左下角（比例达到95% 左右），同时在相同参数下使阳性细胞（药物诱导凋亡超过70%） 的大细胞群出现在十字门的右上角，确定实验的检测参数。大体 上，细胞的fl1和fl2信号值正比于volts值。5.