汞胁迫对桐花树幼苗根和叶蛋白质功能的影响

1、汞胁迫对桐花树幼苗根和叶蛋白质功能的影响设计方案目录：1. 研究现状2. 研究目标3. 研究方案 3.1 基本生理指标的测定 3.1.1丙二醛（MDA）的测定 3.1.2 还原糖的测定 3.1.3 叶绿素的测定 3.1.4 谷胱甘肽（GSH）的测定 3.1.5 过氧化物酶（POD）的测定 3.1.6 超氧化物歧化酶（SOD）的测定 3.1.7 过氧化氢酶（CAT）的测定 3.1.8 总汞的测定 3.2 蛋白质指标的测定 3.2.1 超薄切片制作及电镜观察 3.2.2可溶性蛋白含量测定 3.2.3 蛋白的层析分析 3.2.4 非蛋白巯基（non-protein thiol，NPT）含量的测定 3

2、.2.5 细胞可溶部分Hg的分子分布4. 经费预算参考文献1. 研究现状 红树林是指自然分布于热带亚热带海陆交汇的潮间带木本植物群落，是海滩上特有的森林类型, 红树植物是该生态系统各级消费者物质和能量的主要来源，对维护生态平衡，保护海岸生态系统起着重要的作用(林鹏等，1995；林鹏，1997)。红树植物是热带、亚热带海湾河口优势植物种, 是该生态系统的重要初级生产者, 对维护海湾河口地区的生态平衡起着十分重要的作用。近年来，随着江河流域工农业的发展，沿海城市人口与经济的增长，大量排放的污染物汇集于河口、海湾区，从而使重金属污染日趋严重。汞是一种极毒的重金属元素, 其毒性位于各金属之首。汞分为无

3、机汞和有机汞两大类, 后者的毒性比前者更大。当植物体中汞的积累浓度达到一定范围后, 它就会破坏细胞的结构（解凯彬等，2000；李大辉等，1999；施国新等，2000；郝怀庆，2001），轻则使植物体内代谢过程发生紊乱, 生长发育受阻, 重则可造成植物枯萎, 甚至衰老死亡（张义贤，1997）。由于它极易经大气、水源和土壤进入植物体内, 然后再通过食物链进入动物和人体中, 对其造成极大的毒危害, 有的甚至能引起人的神经系统出现严重缺陷, 表现出强烈的致畸、致癌和致突变活性。桐花树（Aegiceras corniculatum）是具有一定的耐盐和泌盐性红树植物，也是我国分布最广的红树树种之一（高桂娟

4、等，2009）。本文以红树植物桐花为材料，观察其在不同Hg浓度胁迫下的生理生态变化，以及叶、根细胞中蛋白质的适应性变化，为揭示红树植物的耐Hg机制提供一些理论和实践依据。2. 研究目标 红树林作为一种海岸潮间带森林生态系统, 对海湾河口区域的污染具有较高承载力和耐受性。目前，在红树植物对重金属污染响应方面的研究主要集中于红树植物对重金属的富集以及生长、形态和生理学方面, 对红树植物抗污染胁迫的分子机理方面的研究还极少有报道。分子生物学和生态学原理的结合, 为污染生态学的研究开辟了一个广阔的研究领域（李裕红，章幼玉，2007）。 本实验以红树植物桐花为材料，观察其在不同Hg浓度胁迫下的生理生态变

5、化，以及叶、根细胞中蛋白质的适应性变化，为解释红树植物的耐Hg机制提供一些理论和实践依据。在蛋白质水平探讨红树植物对重金属具较高耐受性的分子生态机理, 可能发现在红树植物中普遍存在的高效的重金属结合物质及其控制基因, 可为汞污染的植物生理学监测提供理论基础，也可为研究红树植物抗重金属污染机制及红树林生态环境的保护提供科学依据和实践依据。3. 研究方案挑选当年生株高约2030 cm，45对叶片，且生活力强，无病虫害，大小相近的桐花树（Aegiceras corniculatum）幼苗进行试验。首先进行水培，加1/4 Hogland营养液于实验室外自然光下复壮一周（室温约25 ），准备实验。复壮后

6、，幼苗用自来水冲洗干净并用超纯水冲洗3遍后进行不同浓度的Hg（0、0.2、1、10、50 ppm）胁迫处理，胁迫液为HgCl2溶液和1/4 Hogland营养液的混合液。每处理3个重复，每重复56株幼苗。5天后分别取5种胁迫浓度的秋茄幼苗进行实验。3.1 基本生理指标的测定3.1.1丙二醛（MDA）的测定采用硫代巴比妥酸法测定秋茄叶片和根的MDA含量。参照赵世杰等方法，选取新鲜成熟叶，去除中脉剪碎混匀称取0.5 g样品，加入3 mL 10TCA和少量石英砂，研磨至匀浆移至15 mL离心管；再加入2 mL 10TCA将研钵中的残渣洗入离心管。匀浆在4000 r/min离心10 min。测定：取上

7、清液2 mL（对照组2 mL H2O）于新的15 mL离心管中，加入2 mL 0.6%TBA（用10%三氯乙酸配制）混匀，离心管盖子拧紧。混合物于沸水浴中沸煮15 min，迅速冷却后在4000 rpm，4，离心20 min。取上清液测定OD532、OD450。计算：提取液中MDA的含量C(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450然后计算每克样品中MDA含量3.1.2 还原糖的测定采用蒽酮比色法（李合生，2000）测定秋茄叶片的可溶性糖含量。称取干样0.05000.1000 g(0.05000.0700 g），分别加入15 mL刻度离心管中；加蒸馏水10 mL，置沸水浴中提取30

8、min，冷却离心，上清液倒入50 mL PE瓶中，再往离心管中加10 mL蒸馏水，置沸水浴第二次浸提，上清液倒入PE瓶中，向瓶中加入蒸馏水至50 mL左右，称重。吸取测定液0.5 mL于大试管中，加蒸馏水摇匀，加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯，放入波长630 nm的分光光度计中比色。结果计算：可溶性糖测定液糖含量(g)×10-6/干样重(g)×分取倍数×1003.1.3 叶绿素的测定 参照张宪政（张宪政，1986）的乙醇-丙酮混合液法略有改进。选取新鲜成熟叶片，去除中脉剪碎混匀称取0.10.2 g叶片。等体积乙醇、丙酮混合液10 mL浸泡（乙醇：丙酮：水=4.5：4.

9、5：1），并用保鲜膜封口防止提取液挥发，置于阴暗处并定期震荡。浸泡至组织变白后，使用紫外分光光度计分别于波长663 nm、645 nm处测定其抽提液的OD值。根据以下公式计算叶绿素含量：Ca=12.7×OD6632.69×OD645 (2.1) Cb=22.9×OD6454.86×OD663 (2.2)Ca+b=8.02×OD663+20.20×OD645 (2.3)叶绿体色素的含量= （mg/g）（C为叶绿素浓度，以g/mL表示）3.1.4 谷胱甘肽（GSH）的测定（1） 谷胱甘肽标准曲线的制作取6支试管编号，按下表加入各种试剂，混

10、匀，25保温反应10 min。以0号管为参比调零，测定显色液在波长412 nm 处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量为横坐标，绘制标准曲线。表 1 谷胱甘肽标准曲线制作时各试剂加入量试管号100mol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml蒸馏水/mL0.1mol/L PH7.7磷酸缓冲液0.1mol/L PH7.7磷酸缓冲液相当于还原型谷胱甘肽物质的量/mol001.01.00.5010.20.81.00.52020.40.61.00.54030.60.41.00.56040.80.21.00.58051.001.00.5100（2） 提取 称取1 g 样品于研钵中，加入5 mL 经4

11、预冷的50 g/L三氯乙酸溶液（含5 mmol/LNa2-EDTA），在冰浴条件下研磨成匀浆，于4、19000 g离心15 min（15 mL离心管）。收集上清液用来测定谷胱甘肽含量，测量提取液总体积（V？）（3） 谷胱甘肽的测定 GSH测定液的制备：将液氮固定的鲜样组织放于研钵中，加入一定量的0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（含0.005 mol/L EDTA）（PH 8.0）和25%偏磷酸（HPO3），并加少量石英砂，冰浴上充分研磨，冷冻离心（4，18000 g 15 min），上清液冷藏用于GSH的测定。GSH测定采用荧光分光光度法，参照Gupta等和Hissin等的方法（？）。 测定：取

12、1支5 mL离心管，依次加入1 mL蒸馏水、1 mL0.1 mol/L磷酸缓冲液（PH7.7）和0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液。以此溶液作为参比，在波长412 nm处对分光光度计进行调零。另取2支试管，分别加入1 mL（Vs）上清液、1 mlL0.1 mol/L磷酸缓冲液（PH7.7）。向一支试管中加入0.5 mL 4 mmol/L DNTB溶液，另一支试管加入0.5 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（PH6.8）。将两支反应管置于25保温10 min。按照标准曲线的方法，迅速测定显色液在波长412 nm处的吸光度，分别记做ODS和ODC。（4

13、）结果计算 显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度（ODS）和空白对照管反应混合液的吸光度（ODC）。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量（n），计算其含量（mol/g）。还原性谷胱甘肽含量（mol/g）=（n×V）/（Vs×m）其中：m为样品质量3.1.5 过氧化物酶（POD）的测定（1）原理：采用愈创木酚法（刘祖祺，张石城, 1994？）测定POD过氧化物酶。以每分钟内 A470 变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。POD活性=A470×1000/P×V×0.01u/mg Pro （2.7)其中：A470-1

14、 min内吸光度的变化； P-蛋白浓度，g/mL； V-取用酶液体积，mL。（2）试剂：反应混合液：100 mmol/L磷酸缓冲液（PH6.0）50 mL，加入愈创木酚28 mL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19 mL，混合均匀，保存于冰箱中。（3）试验步骤： 粗酶液提取：称植物叶片0.5 g于研钵中分次加入0.05 mol/L预冷的磷酸缓冲液5 mL以及少量（1 mL）的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），在冰浴下，研磨成匀浆，转移至15 mL离心管中，再用4ml缓冲液清洗研钵中的残渣。匀浆在高速冷冻离心机上419000或4000 r/min（最大离心率）

15、离心10 min,收集的酶液用于活性测定。（提取的酶液即为10 mL） 酶活性的测定：取光径1 cm比色皿2只，于一只中加入反应混合液3.9 mL，KH2PO4 0.1 mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3.9 mL，酶液 0.1 mL，立即开启秒表计时，于分光光度计470 nm波长下测量OD值，每隔1 min读数一次。以每分钟OD变化值表示酶活性大小。3.1.6 超氧化物歧化酶（SOD）的测定（1）原理：采用氮蓝四唑（NBT）法（李合生, 2000）测定SOD超氧化物歧化酶。已知 SOD 活性单位以抑制NBT光化学还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD活性=2

16、（ACK-AE）×V/ACK×W×Vt(2.5)； SOD比活力=SOD活性/蛋白质含量 (2.6)其中：ACK-照光对照管的吸光度； AE-样品管的吸光度； V- 样品液的总体积，mL； Vt-测定时样品用量，mL； W-样品鲜重，g。 SOD 活性单位 U/g FW，蛋白质含量单位为 mg/g，SOD 比活力单位为U/mg蛋白。（2） 试剂： 0.05 mol/L磷酸缓冲液（PH 7.8） 130 mmol/L甲硫酸铵（Met）溶液：称取1.9399 g Met用磷酸缓冲液定容至100 mL 750 mol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133g NBT用磷酸

17、缓冲液定容至100ml，避光保存。 100 mol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721 g EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠），用磷酸缓冲液定容至1000 mL 20 mol/L 核黄素溶液：称取0.0753 g 核黄素用蒸馏水定容至1000 mL 避光保存。（3）仪器：高速台式离心机，分光光度计，荧光灯（反应试管处照度为4000lx）（4）具体步骤： 酶液提取： 称植物叶片0.5 g于研钵中分次加入0.05 mol/L预冷的磷酸缓冲液5 mL以及少量（1 mL1%）的PVP，在冰浴下研磨成匀浆，转移至15 mL离心管中，再用4 mL缓冲液清洗研钵中的残渣。匀浆在高速冷冻离心机上4

18、19000 r/min离心10 min,收集的酶液用于活性测定。（提取酶液即为10 mL） 显色反应：取5 mL透明度好的指形管4支，2支为测定管，2支为对照管，按下表加入各溶液。混匀后，将1支对照管放置在暗处，其它各管于4000lx日光下反应20 min。 SOD活性测定：反应结束后，用黑布罩于其它试管，终止反应，以不照光的对照管作为空白，分别在560 nm波长下测定各管的吸光度，计算其活性。3.1.7 过氧化氢酶（CAT）的测定（1） 试剂： 0.2M PBS 0.1 mol/L H2O2：（市售30%H2O2约为17.6 mol/l，取30% H2O2溶液5.68 mL，稀释至1000

19、mL，用标准的0.1mol/lKMnO4溶液酸性条件下进行标定） 0.1 mol/L KMnO4溶液：KMnO4分析纯3.1605 g，用新煮沸冷却的蒸馏水配制成1000 mL（2） 酶液提取： 称植物叶片0.5 g于研钵中分次加入0.05 mol/L预冷的磷酸缓冲液5 mL以及少量（1 mL 1%）的PVP，在冰浴下研磨成匀浆，转移至15 mL离心管中，再用4 mL缓冲液清洗研钵中的残渣。匀浆在高速冷冻离心机上44000 r/min离心10 min,收集的酶液用于活性测定。（提取酶液即为10 mL）（3） 测量：取10 mL试管5支，其中4支样品管，1支空白对照管按下表加入各试剂。表2 过氧

20、化氢酶测定时各试剂加入量试管号蒸馏水（mL）粗酶液（mL）PBS（mL）S01.00.21.5S11.00.21.5S21.00.21.5S31.00.21.5S41.00.21.53.1.8 总汞的测定用 Teflon罐消解样品，F732-V智能型冷原子吸收测汞仪测定总汞，同样的方法测定标准和空白。每个样品作三个平行样，取平均值。具体步骤如下：植物样品 60烘干过夜，称量根茎叶的总量之后，研磨，过 100目筛，称取 0.20 g植物样品（记录每份样品质量）于 15 mL Teflon罐中，加入 5mL 浓硝酸，置于烘箱中 85消解 4 小时，此时植物全部消解完全，消解液为澄清。静止冷却，过滤

21、并定容至 50 mL容量瓶。从容量瓶中吸取0.5 mL溶液进样，加入1 mL10%氯化亚锡，测定含量。（根、叶中汞含量分析）3.2 蛋白质指标的测定3.2.1 超薄切片制作及电镜观察胁迫5天后，分别取对照与各浓度梯度处理的桐花幼苗的叶片，洗净，将样品放在冷的固定液中切成0.5 cm的长度（1 mm的柱状）。迅速地将样品放在前固定液并冷藏于4的环境中。2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。用0.1 M PBS 漂洗3次，每次15分钟，用1% OsO4 4避光固定23小时，漂洗后丙酮系列脱水。包埋后超薄切片机切片6080 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，JEM-2100透射电镜（生

22、科院可预约）观察、拍片。3.2.2可溶性蛋白含量测定 按照李合生等的方法（李合生，2000）用考马斯亮蓝G-250进行染色，在波长为595 nm处进行比色。用牛血清蛋白作为标准蛋白。（1）试剂: 标准蛋白质溶液:100 g/mL牛血清白蛋白:称取牛血清白蛋白25 mg,加水溶解并定容至100 mL,吸取上述溶液40 mL,用蒸馏水稀释至100 mL即可。 考马斯亮蓝G-250溶液：称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 90%乙醇中，加入100 mL 85%（w/v）的磷酸，再用蒸馏水定容到1 L，贮于棕色瓶中，常温下可保存一个月。（2）仪器：722分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，

23、移液管，具塞刻度试管（3）具体步骤： 标准曲线制作：取6支具塞试管按表所列加入各试剂，摇匀。放置3 min，用1 cm光径比色皿在595 nm波长比色。以牛血清蛋白含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。表3 可溶性蛋白含量测定时标准曲线制作试剂加入量试管号123456蛋白标准溶液/mL00.200.400.600.801.00蒸馏水量/mL1.000.800.600.400.200考马斯亮蓝/mL555555蛋白质含量/g020406080100 样品测定：取酶提取液40 L，置于具塞试管中，加入pH7.8的磷酸缓冲溶液至总体积为1 mL，加入5 mL考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置3 mi

24、n。595 nm波长比色，比色反应在1 h内完成？。 计算：根据样品提取液的吸光度，从标准曲线中查出相应的蛋白质含量，按下式计算样品中蛋白质含量。P=（C×V）/（W×Vt）其中：C-查得的蛋白质含量（由标准曲线求得），g； V-提取液总体积，mL； Vt-测定时所吸取的体积，mL； W-样品重，g； P -蛋白质含量（鲜重），g/g。3.2.3 蛋白的层析分析（方法有待完善）桐花幼苗用HgCl2溶液培养5d 后,分别取根和叶片,用蒸馏水冲洗干净,吸水纸吸干表面水分，称重，然后用Tris HCl 10 mmol/ L（pH 8. 6） 缓冲液在研钵中磨成匀浆（材料与缓冲液的

25、比为12）。搜集匀浆在4 低温下12 000 ×g离心45 min。上清液经Sephadex G275 柱(1. 5 ×100) 分离。以Tris HCl 10 mmol/ L （pH 8.0，含NaCl 0.1 mol/ L）为平衡和洗脱液。上柱样品为3ml ，流速为40 ml/ h ，按6. 67 ml/管分部收集洗脱液。每管洗脱液中Pb 含量用日立Z28000 原子吸收光谱仪测定。分子量鉴别用标准蛋白质为牛血清蛋白（67 kD）、卵清蛋白（44 kD）、胰蛋白酶（23. 5kD）、细胞色素C（12. 3 kD） 和胰岛素（6 kD） (杨居荣等1993)。3.2.4

26、非蛋白巯基（non-protein thiol，NPT）含量的测定非蛋白巯基（non-protein thiol，NPT）采用DTNB 显色法（Rama Devi S, Prasad M N V，1998）测定。称取样品鲜样1.00 g，加入4 mL 预冷的5%（W/V）磺基水杨酸，冰浴研磨，冰浴30 min，然后离心（8 000×g，4 ）15 min。取上清液0.8 mL，依次加入3.05 mL 0.25 mol·L-1 的Tris-HCl （pH8.3） 和0.15 mL 10 mmol·L-1 的DTNB，室温下放置20 min，然后用分光光度计（波长41

27、2 nm）测定样品吸光度值。非蛋白巯基（non-protein thiol，NPT）是植物重金属解毒机制中的主要物质之一，它主要由富含巯基的物质组成，包括植物螯合肽（PCs）、谷胱甘肽（GSH）、-谷氨酰半胱氨酸（-EC）、半胱氨酸（cysteine）等（安志装等，2004）。巯基能结合Hg离子，减少细胞内自由态Hg，达到解毒的目的。因此，桐花树不同部位的NPT 含量可以反映桐花树对Hg 的耐受能力。3.2.5 细胞可溶部分Hg的分子分布（方法有待完善）参考Guo 等的方法，分别称取Hg 处理的鲜样约8.5 g，加入17 mL 预冷的匀浆液（50 mmol/L Tris-HCl（pH8.6），

28、1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF），用差速离心法分离出细胞可溶部分，冷冻干燥，复溶，过滤后，用葡聚糖凝胶G-75 柱（Sephadex G-75 Fine）进行凝胶过滤，每管5 mL，收集40 个流分。将每个流分分装，一部分用ICP-AES 测定Cd 浓度，另一部分用磺基水杨酸酸化沉淀蛋白，离心，取上清液，用DTNB 显色法（Rama Devi S, Prasad M N V，1998）测定NPT 浓度。4. 经费预算本实验主要分为桐花树基本生理指标的测定和蛋白指标的测定，基本生理指标测定的费用主要是试剂和药品的购买，费用不会过多；桐花树蛋白指标的测定和蛋白层析的费用还有待进一步确定。参考文献1林鹏,傅勤. 中国红树林环境生态及经济利用M. 1995，北京：高等教育出版社.2林鹏. 中国红树林生态系统M. 1997，北京：科学出版社.3解凯彬,施国新,杜