生化作业答案

1、一、两种蛋白质相互作用研究方法的原理与基本操作流程。（1）酵母双杂交系统原理：当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。基本操作流程：a、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。b、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。c、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。d、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能

2、与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。（2）噬茵体展示技术原理：将待筛选的蛋白基因插入到噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因8或基因3之间，构建成融合蛋白噬菌体文库，表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，而不影响噬菌体的完整性。每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链，不同噬菌体粒子展示不同序列的外源肽链。利用目的蛋白与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。基本操作流程：a、构建噬菌体库b、进行亲和筛选c、分析所筛选克隆亲和性（3）免疫共沉淀技术 原理： 基本操作流程：A、收获细胞，冷PBS洗涤两次，细胞裂解液

3、冰浴裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 最大转速离心30 min；B、取上清液加入适量抗体，4°C缓慢摇晃孵育过夜；C、取10l protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；d、加入琼脂糖凝胶悬液，4°C缓慢摇晃孵育2-4h；e、细胞裂解液洗涤琼脂糖凝胶混合液，离心弃去上清液；沉淀加2x蛋白Loading Buffer煮沸5-10min，离心，上清液跑SDS-PAGE胶；f、考马氏亮蓝染色、银染，Western blotting或质谱仪分析。（4）GST 融合蛋白pull-down技术 原理：基本流程：（5）融

4、合蛋白亲和色谱法原理：首先将“诱饵”蛋白吸附在相应的亲和柱上，当细胞抽提液经过该柱时，与“诱饵”蛋白有相互作用的“猎物”蛋白被吸附，进一步利用洗脱剂将吸附的蛋白复合物洗脱进行鉴定。（6）表面等离子共振技术原理：利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。基本操作流程：（7）荧光共振能量转移荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强

5、度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。二、查阅相关资料，理清胰岛素与胰高血糖素对糖脂代谢的调控机理，以及两者之间的协作。胰岛素调控机理：胰岛素与其受体结合，激活受体络氨酸酶激酶，引起胰岛素受体底物的磷酸化，胰岛素受体磷酸化后，激活靶细胞细胞膜载体蛋白，使血液中的葡萄糖转运到细胞中；络氨酸磷酸化受体与信号分子通过共价修饰，增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP浓度；通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化；通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖异生。胰高血糖调控机理： 通过cA

6、MP-PK系统，激活肝细胞的磷酸化酶，加速糖原分解。糖异生增强是因为激素加速氨基酸进入肝细胞，并激活糖异生过程有关的酶系。胰高血糖素还可激活脂肪酶，促进脂肪分解，同时又能加强脂肪酸氧化，使酮体生成增多。胰高血糖素产生上述代谢效应的靶器官是肝，切除肝或阻断肝血流，这些作用便消失。两者之间的协作：胰岛素的作用是降低血糖，胰高血糖素的作用是升高血糖。 胰岛素和胰高血糖素的关系是拮抗作用。 血糖的浓度是要维持在一个稳定的水平的，过高和过低都不行。当血糖过低时，胰高血糖素分泌增多，升高血糖含量；当血糖过高时，胰岛素分泌增多，降低血糖含量。 在血糖偏高时，为了维持血糖含量的正常，这时胰岛素分泌会增多，从而

7、降低血糖的含量来达到正常的水平；随着胰岛素分泌的增多，胰岛素会反作用于下丘脑和垂体，抑制胰高血糖素分泌激素的分泌，从而抑制了胰高血糖素的合成，也就抑制了它的分泌。 同理，在血糖浓度偏低时，胰高血糖素分泌增多，从而升高血糖含量；但随着血糖含量的升高，胰岛素分泌也会逐渐增多，不让血糖升得太高，维持血糖的平衡。三、查阅相关资料，理清肝细胞在哺乳动物代谢中的重要作用。肝细胞能合成多种血浆蛋白质（白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原及多种血浆蛋白质）。在血浆蛋白质的处理上肝起着重要作用。白蛋白以外的血浆蛋白质都是含糖基的蛋白质，它们在肝细胞膜上的唾液酸酶的作用下，失去糖基末端的唾液酸，就可被肝细胞上的特异受体肝

8、糖结合蛋白所识别，并经胞饮作用进入肝细胞而被溶酶体清除。 肝内含有丰富的与氨基酸分解代谢有关的酶类，由食物消化吸收而来的和组织蛋白分解而来的氨基酸大部分被肝细胞摄取，经过转氨基、脱氨基、转甲基、硫和脱羧等反应转变成酮酸及其他化合物。除亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸这三种支链氨基酸主要在肌肉组织降解外，其余氨基酸特别是苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸等芳香氨基酸都主要在肝内进行分解代谢。肝是合成尿素的重要器官，肝细胞功能严重障碍会引起血中多种氨基酸的含量增高，血氨浓度增高、血中尿素浓度降低。 肝脏是维持血糖浓度相对稳定的重要器官，肝有较强的糖原合成与分解的能力，通过糖原的合成与分解而调节血糖。肝是进行糖异生的

9、重要器官，可将甘油、乳酸、氨基酸等转化为葡萄糖或糖原。肝还可将半乳糖、果糖等转化为葡萄糖。 肝在脂类的消化、吸收、运输、合成及分解等过程中起重要作用。肝合成甘油三酯、磷脂及胆固醇的能力很强，并进一步合成VLDL及HDL.某些载脂蛋白（如ApoA、ApoB100、ApoC、ApoC等）以及卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）在肝细胞中合成，它们在脂蛋白的代谢及脂类运输中起着重要的作用。肝对甘油三酯及脂肪酸的分解能力很强，是生成酮体的重要器官。 肝在维生素的吸收、储存和转化方面都起着重要作用。维生素A、D、E、K及B在肝内储存，胡萝卜转变成维生素A，维生素D3在C25位上的羟化，由维生素PP合成NA

10、D+和NADP+，由维生素B1合成TPP等过程均在肝内进行。 肝与许多激素的灭活和排泄有密切关系，血中的类固醇激素在肝内灭活，生成种种代谢产物（如17-羟类固醇、17-氧类固醇），有的代谢产物在肝脏进一步与葡萄糖醛酸或硫酸结合，再从尿液或胆汗排出。胰岛素及其他多种蛋白质或多肽激素以及肾上腺素、甲状激素等也都在肝内灭活。因此，当发生严重肝功能损伤时，体内多种激素因灭活而堆积，会导致相应的激素调节功能紊乱。肝细胞作用包括：1、合成-合成凝血因子和血清白蛋白，还有多种消化酶以及胆汁的主要成分；2、内分泌调节-代谢多种人体激素，例如雌激素，雄激素等等；3、代谢-从肠道吸收的营养物质均被肝细胞加工处理，

11、葡萄糖、氨基酸、脂肪都可以处理；4、储能-把葡萄糖合成糖原储存起来，在人体需要的时候也可以释放出来供人体使用。5、清除毒素-把内源和外源的各种毒素变成对身体无害或者低毒的物质，或者把毒物变成水溶性的物质使之容易排出；6、肝细胞形成的窦状结构还可以作为一个体内的血库，也使许多免疫细胞在其中停留发挥免疫作用。四、查阅相关资料，理清实时定量PCR引物设计与标准PCR引物设计的一般原则有何异同。相同点：1、引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。2. 产物不能形成二级结构3、G+C含量在40%60%之间。4、碱基要随机分布5. 引物自身不能有连续4个碱基的互补。6. 引物之间不能有连续4个碱基的互补

12、。7、引物3端要避开密码子的第3位。8. 引物5端可以修饰。9. 引物3端不可修饰。10、引物自身及引物之间不应存在互补序列。11、引物整体设计自由能分布5端大于3端，3端G值较低12、引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70或者有8个互补碱基同源。不同点：标准PCR1、引物长度一般在1530碱基之间。引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38 。2、引物3端不能选择A，最好选择T。3、Tm值最好接近72。实时定量PCR引物设计1、引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp区域内，2、引物长度一般在17-25碱基之间，上下

13、游引物不能相差太大。3、产物自由能小于58.61KJ/mol4、引物3端不能选择A，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。5、3端自由能最好小于9KJ/mol6、TM值在55-63度之间。五、查阅相关资料，理清“蓝白斑筛选”选择重组子的基本原理及相关细节问题，包括宿主菌的遗传背景要求等。蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨

14、基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。在筛选中应注意1、质粒的质量和浓度

15、用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的10。 2、防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 3、显色反应的时间 需要将平板放入4冰箱中3-4h，使得显色反应充分。 4、平板的涂布 菌液涂平板的时候要避免来回涂布，否则过多的机械挤压涂布会导致细胞破裂，影响转化效率。设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为-半乳糖苷酶缺陷型菌株，这种宿主菌的染色体基因组