流式细胞仪培训手册

1、流式细胞仪培训手册序论学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScanTM，FACSortTM，FACSCaliburTM，和BD LSR）及大型机（FACS VantageTM，FACSVantageTM SE，和FACStarPLUSTM）之间的不同。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。目录第1章 综述4第2章 液流系统第3章散射光信号及荧光信号3.1 散射光信号3.2 荧光信号3.3 荧光补偿第4章光电系统4.1 光平台4.2 光学滤片4.3 信号探测器4

2、.4 阈值第5章数据分析5.1 数据采集及显示5.2 设门5.3 细胞亚群的数据分析5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析5.5 CellQuest软件使用5.6 MutiSet软件使用5.7 Simultest软件使用5.8 B27软件使用5.9 WinMDI软件使用5.10 FACSPress软件使用5.11 System II软件使用5.12 MultiCycle软件使用5.13 Modfit使件使用第6章流式基本检测项目6.1 淋巴细胞亚群检测 （双色、三色、四色，三种软件分析）6.2 B27的检测6.3 血小板抗体检测 6.4 网织血小板及红细胞分析 6.5 干细胞检测 6.6 DNA

3、倍体分析 6.7 凋亡检测第7章分选6.1 分选第8章激光器及光路校正7.1 激光器的工作原理7.2 光路校正第9章答案第一章 综 述流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下：·液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。·光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。·电系统：把光信号转换为电信号

4、。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行

5、分析。图1-1 散射光和激发光信号转换成为计算机可处理的充电脉冲习题：概览1 流式细胞仪可测量细胞或粒子的哪些属性？2 大多数流式细胞仪使用何种光源？3 流式细胞仪的三大系统是什么？4 哪种类型的生物样本最适于做流式细胞分析？5 液流包绕细胞形成？6 带有荧光的细胞通过激光束时，会产生哪两种光信号？7 由粒子激发的光由 收集。8 所有流式细胞测量是在单个细胞上同时进行吗？（对错）9 在进行流式分析之前粒子必须是单个细胞悬液吗？（对错）第二章液流系统液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。因此

6、，必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞在此及激光相交。流动室内充满鞘液，根据层流原理，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态，这个过程称为流体聚焦。该原理适用于所有流动室，如图2-1和2-2所示：图2-1 细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦，图2-2 细胞液柱通过喷嘴产生流体聚焦样本压力和鞘液压力是不同的，且样本压力总是大于鞘液压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。&#

7、183;台式机：单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出，粒子或细胞在流动室内及激光相交（图2-1）。除BD LSR型台式机有样本压力细调旋钮外，大多数台式机都采用固定的样本压力（分低，中，高速）。·大型机：单个细胞悬液从喷嘴喷出后，粒子或细胞在流动室外及激光相交（图2-2）。且样本压力连续可调。增加样本压力就是通过加宽液柱的方法增加样本流速。换言之，在特定时间内，允许更多细胞通过液流。当液柱变宽时，一些流经激光束的细胞会偏离中心，光斑也会偏离理想角度，这在一定程度下是允许的。·高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流经激光照射区的细

8、胞数量增加，可以快速获取数据。·低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节样本压力对实验操作是至关重要的。习题：液流系统1 流式细胞仪中液流系统的作用是什么？2 细胞流经激光束时影响激光照射细胞的两个因素是什么？3 在特定时间内，应该有多少细胞流过激光束？4 单个细胞悬液在 内注入 。5 鞘液环包样品并使之居中的过程称为 效应。6 什么调节器可以控制细胞液柱的宽窄？7 对于台式机，样本的固定压力是多少。8 增加样本压力，也就是

9、 样本流速和液柱。9 DNA研究对检测分辨率要求较高，推荐流速为多少。10 加大流速会降低检测分辨率。（对错）11 定性检测时可使用高流速。（对错）第三章散射光信号和荧光信号的检测上一章我们了解到粒子或细胞是如何依次通过液柱的，本节我们首先学习激光如何照射在单个细胞上的。3.1散射光信号粒子折射激光产生散射光信号。散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理特性，即细胞的大小和内部结构。散射光及细胞膜，核膜以及细胞结构的折射性、颗粒性密切相关，细胞形状和表面形貌也对其产生影响。前向角散射：前向角散射（FSC）光及被测细胞的大小和面积有关，检测的是激光束照射方向及收集散射光

10、信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号（见图3-1）。FSC不受细胞荧光染色的影响，常用于免疫表型分析的信号处理。侧向角散射：侧向角散射（SSC）光及被测细胞的颗粒密度和内部结构有关，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感（见图3-1）。SSC收集及激光束正交90度方向的散射光信号。图3-1 细胞的光散射特性上述两种信号都是来自于激光原光束，目前采用这两个参数组合，可区分不同种类的细胞亚群，同时可获得细胞相关的重要信息，下图（图3-2）为FSC和SSC组成的二维散点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及粒细胞区分开。图3-2 FSC、SSC二维散点图习题：散射光信号1 什么时候会发生

11、光散射现象。2 光散射信号及细胞的哪些特性有关。3 及激光束方向相同的光散射称为 散射。4 FSC及细胞的哪些特性相关？5 及激光束方向呈90度角的光散射称为 散射。6 SSC及细胞的 和 相关。7 和 双参数的组合可区分不同种类的细胞亚群。3.2 荧光信号荧光物质吸收符合其波长范围的光能量，内部电子受激上升到高能级。然后受激电子迅速衰落回基态，释放过剩能量成为光子。这种能量的转换称为荧光。能够激发荧光物质的波长范围称为激发光谱。因为更多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所以发射光波长要高于激发光波长。荧光物质的发射波长范围叫做发射光谱。目前的流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm

12、的激光器能够激发一种以上的荧光（详见第7章）。光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰值，所产生的荧光信号愈强。FITC的激发光谱如图3-3所示，488nm非常接近FITC的激发光谱的峰值，所以FITC被激发时会表现出最强荧光信号，而当FITC被其波谱范围内的其它波长激发时，也会检测到荧光，但信号强度不会这么高。图3-3 FITC、PE、PerCP、APC染料的激发光谱如果激发光波长都是488nm，而发射光波长又不是极其接近的话，我们可以同时检测两种以上的荧光。如FITC和PE双染就符合这种条件。这两种荧光素的发射光谱如图3-4所示。虽然PE的激发光谱的峰值不是488nm，但也足以检测到荧光。

13、更重要的是，FITC的发射光波长是530nm，PE的发射光波长是570nm。他们的发射光波长足够远，可以使用不同的检测器。被检测到的荧光信号数量及粒子中标记上的分子数量成正比。图3-4 FITC、PE、PerCP、APC染料的发射光谱图3-5 荧光标记抗体对细胞表面抗原的特异性结合对单克隆抗体进行荧光染色，通过分析细胞表面抗原标记确认细胞类型（见图3-5）。在细胞的混合群体中，我们使用不同的荧光染料区分细胞亚群。每个亚群的染色模式及FSC和SSC数据相结合，用于识别样本中的细胞种类，并可以得到各细胞亚群的百分含量。而且，还可以对感兴趣的细胞进行再分选。3.3荧光补偿使用流式细胞仪进行多色分析时

14、，由于荧光发射光谱的重叠，需要做补偿调整在流式细胞仪上进行多色免疫荧光分析时，使用的不同荧光素的发射光谱有重叠现象，如果不对这种现象做适当的调整，就会导致某一荧光素发出的荧光被其它“错误”的检测器检测到。这种由于补偿问题导致的错误，会得到假阳性的错误结果，并可能在等高图的多色分析时，得到错误的细胞群体。这里，我们可以通过使用恰当的单染或双染的样本，对补偿加以调整，去除光谱重叠部分的影响信号，就可以准确地在流式细胞仪上进行细胞多色分析了。单克隆抗体偶联上荧光素fluorescein isothiocyanate（FITC）、R-phychoerythrin（R-PE）以及Cy-Chrome，就可

15、以用来检测某一细胞群的多种抗原特性了。在做这样的多色分析时，使用同一波长的激发光（488nm），即15毫瓦氩离子激光。FITC的发射光为绿色荧光（峰值为530nm），信号被FL1检测器检测；R-PE的发射光为橙红色荧光（峰值为575nm），信号被FL2检测器检测；Cy-Chrome的发射光为紫红色荧光（峰值为670nm），信号被FL3检测器检测。但是，FITC的发射光谱有橙红色光，而R-PE的发射光谱也有绿色光，等等，依次类推。这些光谱的交叉重叠，会导致荧光信号被相应检测器以外的错误的检测器探测到。因此，要使用补偿的办法校正这种信号重叠导致的错误。它通过电子补偿的办法，来去除重叠信号的影响，通

16、过电子补偿，使检测到的单染细胞的另外两种荧光信号及未染色细胞的信号水平相同。补偿不足或补偿设置不当，都会导致假阳性结果或人为造成直方图的偏移。例如，在多色分析中，如果荧光染色细胞的补偿设置不足，就可能在双色等高图上显示出一个假的双阳性群体，导致数据分析失误。在三色荧光分析时，为了防止由于补偿造成的错误，应该使用单染细胞调整补偿（另外两种荧光为阴性对照），即用每一个荧光抗体单染细胞，然后调整每两种颜色之间的补偿。双色分析时，可以使用两个互斥的单阳性抗体，通过两种单阳性细胞群体和双阴性群体来调整补偿。为了使测定结果标准化，并达到长期检测仪器性能的目的，应该每日使用标准荧光微球和自动的定标/补偿软件

17、，做荧光补偿的初步调整。流式细胞仪多色分析的补偿调整步1 根据实验室要求，每日做仪器校正（calibration/standardization）。2 检测一个未染色样本（自发荧光），调整前向角散射光FSC和侧向角散射光SSC设置，使测定细胞群体显示好，并可以按要求设门。3 设门后，调整自发荧光的FL1、FL2、FL3的电压设置（detector settings），在对数模式下，使自发荧光位于荧光直方图的左侧（101以内）。比较自发荧光和阳性细胞的荧光强度，保证每个荧光的阳性水平都可以按比例显示。4 使用荧光抗体逐个染色（单染），运行单染样本，调整补偿。监测双色点图，调整补偿设置（compe

18、nsation settings），使染色阳性细胞和未染色阴性细胞在横轴水平，在纵轴垂直。例如，对于PE标记的单克隆抗体染色的细胞群，上下调整FL1-%FL2的设置，使FL2阳性群体及FL2阴性群体上下垂直（FL2 vs FL1点图）；然后，使用FITC标记的单克隆抗体染色的细胞群，左右调整FL2-%FL1的设置，使FL1阳性群体及FL1阴性群体左右水平（FL2 vs FL1点图）。然后，再依次调整第三色补偿FL2-%FL3和FL3-%FL2。5 使用双色补偿质控样本，微调补偿。用FITC和PE单克隆抗体，PE和Cy-Chrome单克隆抗体染色，最好使用单克隆抗体和同型对照染互斥的单阳性细胞群

19、体。可以将两种单染细胞混合，用一个样本管进行双色补偿调整（如混合FITC和PE染色细胞），在缺少互斥标记的情况下，可以使用此方法。每一种细胞群体应位于相应的象限。在某些流式细胞仪上，FL1和FL3不能直接进行补偿。因此，做双色分析时，不需要做FITC/Cy-Chrome补偿对照管。6 检查三色荧光染色的细胞群，在前面的步骤里，已经做好了补偿，因此，这里就不需要再调整了。7 获取样本的对照管和实验管，并保存数据文件。8 每一个多色分析的实验，都需要进行补偿的调整。因此，每做一种多色分析的实验，都要用单染和双染对照样本，按照3-7步做实验条件的调整。为了减少不同试剂间的荧光条件的调整，在开始调整补

20、偿时，首先应选择各荧光通道中染色最强的试剂/细胞。习题：荧光信号1 当荧光物质吸收激光能量，并释放过剩能量时，会发射 。2 荧光物质能被激光激发出荧光的波长范围称为 。3 由荧光染料发射的波长称为 。4 在流式细胞仪中通常采用什么激光器。5 能够激发FITC和PE的波长是多少。6 流式细胞仪最常用的两种荧光素是 和 。7 荧光素标记抗体用于检测 。第四章光学系统光学系统由光学激发器和光学收集器组成。光学激发器包括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。光学收集器则由若干透镜组成，用于收集粒子发射的光束-激光束相互作用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。光平台的设计可实现以上功能。4

21、.1 光学平台流式细胞仪的光平台提供了一个固定平面，将激光源、光学激发器和收集器控制在一个固定的位置。因而台式机的流动室和光路是固定的，能够保证光斑和样本流自始至终保持恒定。图4-1和图4-2分别为台式机FACS Calibur 和BD LSR 的光平台系统。图4-1 台式机FACS Calibur 光平台系统图4-2 台式机BD LSR光平台系统在大型机中，当液流流过喷嘴时，激光束通过消色差透镜组以最佳角度和位置截取液流。由于光斑和液流位置会发生变化，所以大型机的光路没有台式机稳定，需要每日优化。光路不正有可能导致粒子受激光照射的能量不均一，从而被激发出的荧光强度也不相同，造成测量误差。大型

22、机的光平台系统见图4-3。图4-3 大型机FACS Vantage SE 光平台系统习题：光学平台1 光平台为激光器及 提供了一个固定平面。2 保证所有细胞受到均一的光照强度的两个必要条件是什么。3 每次使用大型机时都需要进行光路校正（对错）。4 在台式机中，固定的 能够保证激光截取 的位置是不变的。4.2 光学滤片当细胞或粒子流过激光照射区时，SSC和荧光信号很弱，需要使用光电倍增管（PMTs）收集，而FSC信号很强，由光电二极管收集即可。所有信号经由透镜组和滤片组到达相应的检测器。光电倍增管（PMTs）检测到的荧光信号常常是很微弱的。在光电倍增管（PMTs）前设置滤片可以使相当窄的一波长范

23、围内光通过，提高了荧光信号的纯度和强度，因而每个检测器只有一种指定波长的荧光信号进入而被检测，使光谱带宽接近荧光染料的发射峰值。这种滤片称为带通（BP）滤片。如：FITC检测器前的滤片标志为530/30，其含义是光谱发射波长：530±15nm，或者说允许通过的波长范围在515nm和545nm之间。BP 500/50则表示其允许通过波长范围为475nm-525nm。流式细胞仪中常用的滤片还有长通滤片（LP）和短通滤片（SP），长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500nm以上的光通过，而500nm以下的光吸收或返回。短通滤片及长通滤片相反，特定

24、波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。（见图4-4）。分光器的主要作用是完成光的收发。二色性反射镜就是其中一种。560短通二色性反射镜如图4-1所示发射560nm或小于560nm的波长（如图4-1所示）。大于560nm的波长被反射。图4-4 光线通过长通滤片、短通滤片及带通滤片的波长范围习题：光学滤片1 检测器前放置滤片作用是什么。2 带通滤片530/30发射的波长范围是 到。3 用于选择性地通过特定波段荧光并将另一波段荧光反射至合适的探测器中。4 滤片允许特定波长及以下的光通过，而 滤片允许特定波长及以上的光通过。4.3 光电探测器处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通

25、过光电探测器转换成电信号（电压），然后到相应的通道。BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。光电倍增管（PMTs）对光信号比光电二极管敏感，所以前者用于检测较弱的SSC信号和荧光信号；后者用于检测较强的FSC信号。粒子进入照射区开始散射光或荧光时产生充电脉冲，首先光信号或光子由光电倍增管（PMTs）或光电二极管转换成相应的电信号，产生电流，电流经由放大器，转换成充电脉冲。当粒子位于激光束正中时，脉冲最大，荧光最强。当粒子偏离激光束时，脉冲回到基线（如图4-5所示）。图4-5 充电脉冲的产生充电脉冲的大小取决于光电倍增管前置放大器获得的光子数量，放大器可设置为线

26、性放大或者对数放大（Lin或Log）。对数放大（Log）常常用于把阴性信号从微弱的阳性信号中分离出来；而线性放大（Lin）通常用于放大散射光信号和荧光信号。充电脉冲通过模数转换器把0-1000mV的脉冲转换成为代表0-1,000mV通道的数值。通道数值经由输入输出（GPIO）数据线传送到计算机进行处理显示（见图4-6）。图4-6 模拟信号到数字信号的转换过程习题：光电探测器1 收集FSC光信号。2 敏感度高的 收集SSC光信号和荧光信号。3 探测器产生电流，经由放大器转换成电压。（对错）4 模数转换器（ADC）的作用。4.4 阈值阈值用于设置低于该道值的信号不被处理，只有高于等于阈值道数的信号

27、才会被送入计算机进行处理。每次只能有一个设阈参数。如：对免疫表型实验，阈值应设为FSC，以消除低于阈值道数的碎片。用户可根据实验要求设置其它参数的阈值。第二个阈值适用于配有两个激光器的台式机。如果设置了两个阈值，那么粒子必须同时满足两个阈值的要求才会被当作信号细胞处理。习题：阈值1 FSC阈值用于消除 信号。2 如果设置两个阈值，细胞必须符合其中一个阈值的要求才会被当作信号细胞处理。（对错）第五章 数据分析5.1 数据采集及显示光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。根据FSC标准，数据

28、存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。

29、3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。习题：数据采集及显示1 在直方图中横轴和纵轴分别表示。2 二维点图用于显示 参数。3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 。5.2 设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图习题：设门1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对错）5.3 细胞亚群的数据分析数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细

30、胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。图5-3 选定淋巴细胞亚群设门门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。图5-4 阴性

31、对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002）图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。图5-5 直方图统计结果二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（

32、CD3 FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%。图5-7 散点图统计结果另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图

33、图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比5.4 流式细胞仪的

34、其它应用以及数据分析这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。图5-11 单细胞株分析图除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析

35、。QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。图5-13 细胞周期的DNA直方图习题：数据分析1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？2 见图5-4和图5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。3 LL象限代表双阳性细胞亚群。（对错）4

36、 见图5-6和图5-7，淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。5 只能使用矩形设定细胞区域范围。（对错）6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。5.5 CellQuest和CellQuest Pro软件使用CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感。C

37、ellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上。1软件数据流程 在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分：方案和数据包。方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门及门、门及图之间的逻辑关系。可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。每个采集方案分析样本后会生成数据包，该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0。CellQuest和CellQuest Pro方案文件的图标CellQuest和CellQuest Pro数据文件的图标CellQue

38、st和CellQuest Pro软件中还会有关于仪器设置的文件，保存所有的实验条件。它只能由CellQuest和CellQuest Pro软件打开。数据包必须由方案文件打开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI。2.软件及仪器的连接流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。1、 先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。2、 在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuest Pro软件。3、 从Aquire菜单下选择connet to cytometer。3方案及数据之间的关系CellQuest和C

39、ellQuest Pro软件的方案及数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。CellQuest和CellQuest Pro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。当图的属性为Acquire时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒；当图的属性为Analysis时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。当图的属性为Acquire-Analysis时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-A

40、nalysis属性。CellQuest Pro CellQuest4方案的建立A选择实验参数默认情况下，FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器，及五个参数供选择使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动打开633nm激光器。选择Four Color后，仪器自动打开第二根激光器，且此时FL4可用。B,建立散点图或直方图，命名坐标CellQuest Pro软件主要工作界面，软件类似于Office word的工作面，可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。使用工具条可以建立散点图、直方图并在图上设立各种门

41、。在CellQuest Pro软件中，如果Inspector窗口开着的话，选中任意直方图或散点图就会出现该图的属性，其中包括有X、Y轴的参数、是否多色显示、图的分析或采集属性等等。在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来打开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。在菜单上选择Acquire栏目，选择Parameter Description，可出现关于文件存储和参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名

42、，FL1为CD3FITC，FL2为CD4PE。C,设门并建立门及图之间的关系在工具栏上有左侧几个按钮可分别矩形门、自由门、线性门、圆形门和自动门。本处重点介绍Snap-To门，它可根据细胞群体的分布自动调整门的形状适应细胞群体。R及G的关系R是Region的首个字母，Region一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。区域及区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：Gate实际了个代数式，简称G，其运算式默认如下：G1 = R1，或G2=R2当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1 AND R2。此时G1就成了一个算术结

43、果了。G1=R1 AND R2G2=R1 NOT R2G3=R1 OR R2Region List管理门，可以重命名或删除门。Gate List是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具。建立门及图之间的关系打开要编辑的直方图或散点图的属性对话框，选择Gate选项，选择门即可。D，显示统计参数如何编辑这些统计参数选择统计参数框，在Stats菜单下的Edit Statistic会变得可用，点出后出现统计参数编辑对话框。选择任意直方图或散点图，在Stats下拉菜单下会有更种统计参数选项。对应于不同的图出现不同的统计参数。5仪器的操作当计算机及流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框：在有关仪器操作所有控制选

44、项框都在Cytometer下拉菜单下，同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框：6文件的保存及调用实验或分析过程中所建的方案可以保存下来，通File下拉菜单可以保存这些方案文件：如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可；方案可以分析以往的数据包（前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性），有两种方案打开以往的数据：方法一：选择直方图或散点图，打开该图的属性框（Plot->>Format），见下图：在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包。方法二：选中方案中所有的直方图或散点图，打开Plots菜单，选择Chang Data File，打开

45、要分析的数据包。附：CellQuest Pro软件所有下接菜单5.6 MutiSet软件使用MultiSET是BD公司的一个全自动获取分析软件。它使用免洗试剂（TriTEST三色试剂或MultiTEST四色试剂）制备标本，可以用来做外周血的淋巴细胞及亚型分析，同时使用TruCOUTNT,可以进行绝对计数。MulSET设门分析，用Attractor定出淋巴细胞亚型区域。Attractor具有自动检查细胞位置漂移的功能，并自动居中。因此，使用Mul软件，可以提高实验室的工作效率和计数的精确度。1. MultiSET文件生成的文件类型：Schedule Document File (【DDMMYY】

46、Sch)：日程记录文件。 Laboratory Report File(【前缀】【输入号】Lab)：实验室报告，PICT文件。Physician Report File(【前缀】【输入号】Phy)：医生报告，PICT文件。Summary Report File（【DDMMYY】Sum）：总结报告，PICT文件。 Flow Cytometry Standard（FCS）Data File（【前缀】【输入号】【试管编号】）： MultiSET软件可以获取或读取的FCS2.0标准数据格式.Export Document File(【DDMMYY】Exp) ：文本文件,包含标本和试剂信息,以及每管的所

47、有亚群结果.2.软件及仪器的连接 流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。在苹果菜单下点击MultiSET软件(或在Dock界面上点击MultiSET).2. 进入MultiSET MultiSET命令菜单 参数预设: Export Preferences:选择输出格式Tab或Comma;选择报告哪些试验结果,按Select Values to Export. Printing Preferences:选择是否自动打印实验室报告 Laboratory report,医生报告Phys

48、ician report, 总结报告Summary report. Pannels Preferences:预先设定试验项目Run a fixed panel,或任意选定试验项目Run any panel. Events Preferences:选择获取细胞数量. Levey-Jennings Preferences:选择质控统计,每30个一统计(30runs),每60个一统计(60runs),或不统计(None)MultiSET运行程序 Sign In:输入操作者、单位、实验室主任,登记进入MultiSET. Set Up:建立测试要求. FACSComp:运行FACSComp,调整仪器条件

49、. Test Prefs:规定报告内容. Samples:输入标本及病人信息.以下程序自动运行,由MultiSET做提示: Acquisition:标本获取.显示点图,以便查看标本获取情况. Analysis:结果分析.显示点图,以便查看自动分析过程. Lab Report:做实验室报告,显示每个标本的各管结果. Phys Report:做医生报告,显示每个标本的结果及正常值范围. Summary:总结.对当次MultiSET的所有标本的结果做总结.第一步:Sign In:MultiSET软件的起始页.输入操作者姓名,单位名称和实验室主任名称.仪器自动显示流式细胞仪的序列号和型号.点击Acce

50、pt,进入下一工作程序.第二步: Set Up:建立测试要求Data Source 选择数据来源.From Data Files:对以前保存的数据文件做分析.From Cytometer:Acquisition and Analysis:在流式细胞仪上运行标本,获得数据并分析.From Cytometer:Acquisition Only:在流式细胞仪上运行标本,获得数据不分析. Entry Level Prefix 确定数据文件,实验室报告,医生报告等文件名前缀的使用. View Reports 选择读实验室报告和医生报告的时间. Automatic Saving Options 确定自动保

51、存的文件类型及保存位置.选择是否保存Data Report,Physician Report,Summary Report,Export Document.按Location,选择文件保存路径,文件默认路径BD Files:【DDMMYY】Folder(自动生成日期目录).目录名确认后,按Select DDMMYY确定,返回Set Up界面. 第三步: FACSComp:运行FACSComp,调整仪器条件 选择Launch FACSComp,进行Lyse no wash校正. 如果当日已做校正,则选择Skip FACSComp,第四步:Test Prefs:规定报告内容选择是否报告绝对计数,是

52、否报告正常值范围,以及总结报告的形式. Physicians Report Choices 医生报告的亚群选项 Report Reference Ranges 报告正常值范围 Laboratory Report Choices 选择实验室报告内容 Summary Report ID 总结报告编号第五步:Samples:输入标本及病人信息 输入标本名称Sample Name,标本编号Sample ID及病历号Case Number. Panel Name选择每个标本所做的项目. WBC Count 如果您需要绝对计数结果,但不用TruCOUNT绝对计数管,您需要输入WBC计数总量和淋巴细胞百分含

53、量,或输入淋巴细胞计数总量.注意:调用条件,打开CytometerInstrument SettingsOpen(FACStationBD FilesInstrument Settings FilesCalib 或Calib File 如果是对以前检测的数据进行分析,点击Add Sameple,添加数据,进行分析.第六步:Acquisition:标本获取.显示点图,以便查看标本获取情况第七步: Analysis:结果分析.显示点图,以便查看自动分析过程.第八步: Lab Report:做实验室报告,显示每个标本的各管结果.注:可以点击Manual Gate,此时可以更改点图大小,更改坐标轴.按照需要,调整淋巴细胞门或Attractors.第九步: Phys Report:做医生报告,显示每个标本的结果及正常值范围.第十步:Summary:总结.对当次MultiSET的所有标本的结果做总结.5.7 SimulSET软件使用5.8 HLA-B27软件使用 HLA-B27自动软件是BD公司的一个全自动获取分析软件。它是专门用来分析人类白细胞抗原B-27基因表达及否。软件可以自动设门找到CD3+的T细胞群，并分析B27基因是否表达（表达即为阳性结果，反之即为阴性）。HLA-B27软