生物化学（下）：23 柠檬酸循环

1、第十单元第十单元 糖代谢糖代谢l第第22章章 糖酵解作用糖酵解作用l第第23章章 柠檬酸循环柠檬酸循环l第第25章章 戊糖磷酸途径和糖的其他代谢途戊糖磷酸途径和糖的其他代谢途径径l第第26章章 糖原的分解代谢和生物合成糖原的分解代谢和生物合成l第第27章章 光合作用光合作用BiochemistryBiochemistry第第23章章 柠檬酸循环（柠檬酸循环（citrate cycle） （tricarboxylic acid cycle） l概述概述l一、丙酮酸进入柠檬酸循环的准备阶段一、丙酮酸进入柠檬酸循环的准备阶段 -形成乙酰形成乙酰-CoAl二、三、柠檬酸循环概貌及反应机制二、三、柠檬酸

2、循环概貌及反应机制l四、柠檬酸循环的化学总结算四、柠檬酸循环的化学总结算l五、柠檬酸循环的调控五、柠檬酸循环的调控l六、柠檬酸循环的双重作用六、柠檬酸循环的双重作用l七、柠檬酸循环的发现历史七、柠檬酸循环的发现历史BiochemistryBiochemistry概述概述l无氧条件无氧条件下，葡萄糖经过分解代谢形成的丙酮酸，或无氧下，葡萄糖经过分解代谢形成的丙酮酸，或无氧发酵形成乳酸或乙醇。发酵形成乳酸或乙醇。l有氧条件有氧条件下，葡萄糖的分解代谢并不停止在丙酮酸，而是下，葡萄糖的分解代谢并不停止在丙酮酸，而是继续进行有氧分解，最后形成二氧化碳和水。它所经历的继续进行有氧分解，最后形成二氧化碳和

3、水。它所经历的途径分两个阶段，分别为柠檬酸循环和氧化磷酸化。途径分两个阶段，分别为柠檬酸循环和氧化磷酸化。l之所以称为柠檬酸循环是因为在循环的一系列反应中，关之所以称为柠檬酸循环是因为在循环的一系列反应中，关键的化合物是柠檬酸键的化合物是柠檬酸( (CitrateCitrate) )，又因为它有三个羧基，又因为它有三个羧基，所以又称为所以又称为三羧酸循环（三羧酸循环（t triric carboxylic arboxylic a acid cid c cycleycle）, ,简称简称TCATCA循环。循环。柠檬酸循环是在细胞的线粒体中进行柠檬酸循环是在细胞的线粒体中进行的。的。 Bioche

4、mistryBiochemistry一一、丙酮酸丙酮酸进入柠檬酸循环的准备阶段进入柠檬酸循环的准备阶段-形成形成乙酰乙酰-CoA 概述概述 （一）催化丙酮酸转变为乙酰（一）催化丙酮酸转变为乙酰-CoA的反应步骤的反应步骤 （二）对丙酮酸脱氢酶复合体结构和装配的深入（二）对丙酮酸脱氢酶复合体结构和装配的深入 探讨探讨 （三）丙酮酸脱氢酶复合体催化反应的简单图解（三）丙酮酸脱氢酶复合体催化反应的简单图解 (四四) 砷化物对硫辛酰胺的毒害作用（砷化物对硫辛酰胺的毒害作用（HS-基基） (五五) 丙酮酸脱氢酶复合体的调控丙酮酸脱氢酶复合体的调控概述概述 从丙酮酸转变为乙酰从丙酮酸转变为乙酰-CoA可概

5、括为可概括为4步反应。步反应。 催化这些反应的酶是包括丙酮酸脱氢酶在内的多酶复合催化这些反应的酶是包括丙酮酸脱氢酶在内的多酶复合体，由三个酶高度的结合在一起形成的，统称为体，由三个酶高度的结合在一起形成的，统称为丙酮酸脱丙酮酸脱氢酶系。氢酶系。H3C COCOOHHSCoAH3C COSCoA乙酰CoA+CO2丙酮酸脱氢酶复合体NAD+NADH+ H+丙酮酸 缩写缩写 肽链数肽链数 辅基辅基 催化反应催化反应丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶 E1 24 TPP 丙酮酸氧化脱羧丙酮酸氧化脱羧二氢硫辛酸转乙酰基酶二氢硫辛酸转乙酰基酶 E2 24 硫辛酸硫辛酸 将乙酰基转移将乙酰基转移 HS-CoA 到到C

6、oA二氢硫辛酸脱氢酶二氢硫辛酸脱氢酶 E3 12 FAD 将还原型硫辛酸将还原型硫辛酸 NAD+ 转变为氧化型转变为氧化型大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体 TPP TPP 与与 硫辛酸硫辛酸 （一）（一）催化催化丙酮酸转变为乙酰丙酮酸转变为乙酰-CoA的反应步骤的反应步骤 反应历程可以分为反应历程可以分为4步：步： 1、丙酮酸脱羧反应、丙酮酸脱羧反应 2、乙酰基转移到、乙酰基转移到CoA分子上形分子上形 成乙酰成乙酰-CoA 3、还原型二氢硫辛酰转乙酰基酶氧化，形成氧化、还原型二氢硫辛酰转乙酰基酶氧化，形成氧化 型的（二氢）硫辛酰转乙酰基酶。型的（二氢）硫辛酰转乙酰基酶。

7、4、还原型的、还原型的E3再氧化再氧化 丙酮酸脱氢酶复合体催化反应丙酮酸脱氢酶复合体催化反应 的图解的图解(P96图图23-1)H3CCOCOOHCO2TPPH3C CHOHTPPH3C COS L SHSHLSHLSSFADH2FADNAD+NADH+H+CoASHH3C COS CoA丙酮酸乙酰二氢硫辛酸二氢硫辛酸硫辛酸羟乙基-TPPE1E2E3O AE1:丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶 E2:二氢硫辛酸转乙酰基酶二氢硫辛酸转乙酰基酶 E3:二氢硫辛酸脱氢酶二氢硫辛酸脱氢酶E E2E E2 2E E3E E3 3E E1硫辛酸：硫辛酸：Lipoamide 丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶复合体催化反复合

8、体催化反应的图解应的图解羟乙基羟乙基TPPTPP乙酰二氢硫辛酸乙酰二氢硫辛酸乙酰乙酰CoA CoA 柠檬酸循环柠檬酸循环（KrebsKrebs循环循环或或三羧酸循环三羧酸循环） 1937年年Krebs提出。又称提出。又称柠檬酸循环柠檬酸循环或或Krebs循环。循环。 以乙酰以乙酰CoA与草酰乙酸缩与草酰乙酸缩合成柠檬酸（含合成柠檬酸（含3个羧基）个羧基）的反应为起始，对乙酰基团的反应为起始，对乙酰基团进行氧化脱羧再生成草酰乙进行氧化脱羧再生成草酰乙酸的单向循环反应序列。酸的单向循环反应序列。柠檬酸循环柠檬酸循环在线粒体中进行。在线粒体中进行。二二、三三、柠檬酸循环概貌及反应机制柠檬酸循环概貌及

9、反应机制二二、三三、柠檬酸循环概貌及反应机制柠檬酸循环概貌及反应机制 乙酰CoA CO2+H2O+ G TAC2 2次脱羧：次脱羧： 2 2个个CO24 4次脱氢：次脱氢： 3 3个个NADHNADH、1 1个个FADHFADH2 21 1次底物水平磷酸化：次底物水平磷酸化： 1 1个个ATPATP 二二、柠檬酸循环柠檬酸循环 概貌及反应机制概貌及反应机制12345678CoASHO 1、草酰乙酸草酰乙酸与与乙酰辅酶乙酰辅酶A缩合成缩合成柠檬酸柠檬酸(citrate , CA)草酰乙酸草酰乙酸柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶柠檬酸柠檬酸乙酰辅酶乙酰辅酶A A柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶是柠檬酸循环中的限速

10、酶是柠檬酸循环中的限速酶l 这一步是柠檬酸循环的这一步是柠檬酸循环的起始步骤起始步骤。通过这一步，含有。通过这一步，含有两个碳原子的化合物以乙酰辅酶两个碳原子的化合物以乙酰辅酶A的形式进入柠檬酸循环。的形式进入柠檬酸循环。l 催化以上反应的酶是催化以上反应的酶是柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶。l 柠檬酸合成酶属于调控酶。它的活性受柠檬酸合成酶属于调控酶。它的活性受ATP、NADH、琥珀酰琥珀酰- CoA 、脂酰、脂酰- CoA等抑制，它是等抑制，它是柠檬酸循环中的柠檬酸循环中的限速酶限速酶。l 柠檬酸脱水生成顺乌头酸，然后加水生成异柠檬酸。柠檬酸脱水生成顺乌头酸，然后加水生成异柠檬酸。 柠檬酸通过失

11、水形成顺柠檬酸通过失水形成顺-乌头酸，然后再加水到顺乌头酸，然后再加水到顺-乌乌头酸这一不饱和的中间产物上，把羟基从原来的位置转移头酸这一不饱和的中间产物上，把羟基从原来的位置转移到相邻的碳原子上从而形成异柠檬酸。到相邻的碳原子上从而形成异柠檬酸。 催化柠檬酸转变成异柠檬酸的酶称为催化柠檬酸转变成异柠檬酸的酶称为顺顺乌头酸酶。乌头酸酶。2.柠檬酸柠檬酸异构化形成异构化形成异柠檬酸异柠檬酸（i-CA）柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸D-D-异柠檬酸异柠檬酸顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶顺乌头酸酶3.异柠檬酸异柠檬酸氧化形成氧化形成-酮戊二酸酮戊二酸（-KGA )l 柠檬酸循环中包括柠檬酸循环中包括4

12、个氧化个氧化-还原还原 (脱氢）步骤，这是其脱氢）步骤，这是其中一个。中一个。l柠檬酸循环中有两次脱羧反应，这是其中第一次氧化脱柠檬酸循环中有两次脱羧反应，这是其中第一次氧化脱羧反应。羧反应。l催化这一反应的的酶称为催化这一反应的的酶称为异柠檬酸脱氢酶（异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehyclrogenase）。）。异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶D-D-异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸此反应脱氢产生此反应脱氢产生NADH+HNADH+H+ +, , 脱羧产生脱羧产生COCO2 2v催化这一反应的的酶称为催化这一反应的的酶称为异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehy

13、clrogenaseisocitrate dehyclrogenase）。是一个变构调是一个变构调节酶。它的活性受节酶。它的活性受ADPADP变构激活。变构激活。ADPADP可增强酶与可增强酶与底物的亲和力。该酶与异柠檬酸底物的亲和力。该酶与异柠檬酸、镁离子镁离子、NADNAD+ +、ADPADP的结合有相互协同作用。的结合有相互协同作用。4. -酮戊二酸酮戊二酸氧化脱羧氧化脱羧 生成生成琥珀酰琥珀酰CoA 这一步反应是柠檬酸循环中两次氧化脱羧作这一步反应是柠檬酸循环中两次氧化脱羧作用的用的第二个第二个氧化脱羧反应。该反应需要氧化脱羧反应。该反应需要NAD+和和 CoA作为辅助因子。脱下的氢最

14、终交给辅酶作为辅助因子。脱下的氢最终交给辅酶NAD+，生成的还原型辅酶，生成的还原型辅酶NADH也可以进入呼也可以进入呼吸链产生吸链产生ATP。-酮戊二酸脱氢酶系酮戊二酸脱氢酶系-酮戊二酸酮戊二酸琥珀酰琥珀酰-CoA-CoA此反应脱氢产生此反应脱氢产生NADH+HNADH+H+ +, , 脱羧产生脱羧产生COCO2 2催化该反应的酶称为催化该反应的酶称为-酮戊二酸脱氢酶系酮戊二酸脱氢酶系（多酶复合体）（多酶复合体）生成琥珀酰生成琥珀酰CoACoA的硫酯键是高能的，是底物水平磷酸化的硫酯键是高能的，是底物水平磷酸化的第一步的第一步 催化该反应的酶称为催化该反应的酶称为-酮戊二酸脱氢酶系酮戊二酸脱

15、氢酶系，在结构、，在结构、功能上都与催化丙酮酸氧化脱羧的功能上都与催化丙酮酸氧化脱羧的丙酮酸脱氢酶系丙酮酸脱氢酶系十分十分相似，也由三种酶六种辅助因子组成。三种酶分别是相似，也由三种酶六种辅助因子组成。三种酶分别是 E1：-KGA脱氢酶脱氢酶 E2：二氢硫辛酸转琥珀酰酶：二氢硫辛酸转琥珀酰酶 E3：二氢硫辛酸脱氢酶：二氢硫辛酸脱氢酶l 六种辅助因子是六种辅助因子是:TPP、硫辛酸硫辛酸、NAD+、FAD、CoA、 Mg+5. 琥珀酰琥珀酰CoA转变为转变为琥珀酸琥珀酸 并产生一个并产生一个高能磷酸键高能磷酸键l 琥珀酰琥珀酰CoA中高能硫酯键水解，放出的能量直接用于高中高能硫酯键水解，放出的能

16、量直接用于高能磷酸键的生成，催化反应的酶是能磷酸键的生成，催化反应的酶是琥珀酰琥珀酰-CoA合成酶合成酶（succinyl-CoA synthase）或称琥珀酸硫激酶（）或称琥珀酸硫激酶（succinic thiokinase）。）。l 这一步反应是这一步反应是TCA循环中唯一的底物水平磷酸化循环中唯一的底物水平磷酸化步骤，步骤，在在TCA循环中产生了大量能量，只有这步反应产生的循环中产生了大量能量，只有这步反应产生的1分子分子GTP是直接产生的高能磷酸化合物，其余的能量都是以还原是直接产生的高能磷酸化合物，其余的能量都是以还原型辅酶型辅酶NADH或或FADH2形式产生的，需要经呼吸形式产生的

17、，需要经呼吸 链电子传链电子传递才能产生高能磷酸化合物。递才能产生高能磷酸化合物。琥珀酰琥珀酰-CoA-CoA琥珀酰琥珀酰-CoA-CoA合成酶合成酶琥珀酸琥珀酸琥珀酰琥珀酰CoACoA中高能硫酯键水解，放出的能量直接用于中高能硫酯键水解，放出的能量直接用于ATP(GTP)ATP(GTP)的生成的生成6.琥珀酸琥珀酸脱氢生成脱氢生成延胡索酸延胡索酸l 这是这是TCA循环中循环中第三个氧化反应第三个氧化反应，由琥珀酸脱氢酶催，由琥珀酸脱氢酶催化，以化，以FAD为辅基为辅基，因为反应的自由能变化不足以还原，因为反应的自由能变化不足以还原NAD+。l 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶与柠檬酸循环中的其他酶不

18、同与柠檬酸循环中的其他酶不同,琥珀酸脱琥珀酸脱氢酶氢酶位于线粒体内膜上位于线粒体内膜上，是，是TCA循环中唯一与内膜结合的循环中唯一与内膜结合的酶，是线粒体内膜的一个重要组成部分，酶，是线粒体内膜的一个重要组成部分，其余酶位于线粒其余酶位于线粒体基质中体基质中。琥珀酸琥珀酸 延胡索酸延胡索酸琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶7.延胡索酸延胡索酸水合生成水合生成L- 苹果酸苹果酸l这是一个可逆反应，由延胡索酸酶（这是一个可逆反应，由延胡索酸酶（fumarase）或称延胡索酸水化酶（或称延胡索酸水化酶（fumarate hydratase）催）催化。该酶具有立体异构专一性。化。该酶具有立体异构专一性。延胡索

19、酸酶延胡索酸酶L-L-苹果酸苹果酸延胡索酸延胡索酸8. L-苹果酸苹果酸脱氢生成脱氢生成草酰乙酸草酰乙酸这是再生成草酰乙酸反应，完成柠檬酸循环的这是再生成草酰乙酸反应，完成柠檬酸循环的最后一个步骤。最后一个步骤。 L-苹果酸的羟基氧化形成羰基。苹果酸的羟基氧化形成羰基。催化这个反应的酶是催化这个反应的酶是L-苹果酸脱氢酶（苹果酸脱氢酶（L-malate dehydrogenase），它的辅酶是），它的辅酶是NAD+。苹果酸苹果酸被氧化成被氧化成草酰乙酸草酰乙酸L-L-苹果酸苹果酸苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶草酰乙酸草酰乙酸四四、柠檬酸循环的化学总结算柠檬酸循环的化学总结算 柠檬酸循环的总化学反应式

20、如下：柠檬酸循环的总化学反应式如下： 乙酰乙酰-CoA + 3NAD+ + FAD + GDP + Pi 2CO2+ 3NADH + 3H+ + FADH2 + GTP + CoA-SH 从上式可以看出，柠檬酸循环的每一次循环都纳入一从上式可以看出，柠檬酸循环的每一次循环都纳入一个乙酰个乙酰-CoA-CoA分子，即两个碳原子进入循环。又有两个碳原分子，即两个碳原子进入循环。又有两个碳原子以子以 COCO2 2离开循环。但是离开循环的两个碳原子并不是刚离开循环。但是离开循环的两个碳原子并不是刚刚进入循环的那两个碳原子。刚进入循环的那两个碳原子。 l 每一次循环共有每一次循环共有4次氧化反应。参加

21、这次氧化反应。参加这4次氧化次氧化反应的有反应的有3个个NAD+分子和分子和1个个FAD分子；同时有分子；同时有4对氢原子离开循环，形成对氢原子离开循环，形成3个个(NADH+H+)和和1个个FADH2分子。分子。l 每一次循环以每一次循环以GTP（底物水平的磷酸化）的形（底物水平的磷酸化）的形式产生式产生1个高能键。个高能键。l即即：33+ 1 2+1=12 ATPl或：或： 32.5+ 1 1.5+1=10 ATP见见P142第一段第一段：l 在在NADH呼吸链呼吸链中，中，H+经经NADH-Q还原酶还原酶（复合体（复合体）、细胞色素还原酶细胞色素还原酶（复合体（复合体）和和细胞色素氧化酶

22、细胞色素氧化酶（复合体（复合体）从线粒体内膜基质泵到膜外的细胞溶胶侧。从线粒体内膜基质泵到膜外的细胞溶胶侧。l 据当前最新测定，据当前最新测定，一对电子泵出的质子数依次为一对电子泵出的质子数依次为4、2和和4。合成一个。合成一个ATP分子是由分子是由3个个H+通过通过ATP合酶所驱动的。合酶所驱动的。多余多余 的一个的一个H+可能用于将可能用于将ATP从基质运往膜外细胞溶胶。从基质运往膜外细胞溶胶。因此，一对电子从因此，一对电子从NADH传至传至O2 ，所产生的，所产生的ATP分子数是分子数是2.5个个; 从从FADH2传至传至O2 ，所产生的，所产生的ATP分子数是分子数是1.5个。个。呼吸

23、链或电子传递链呼吸链或电子传递链4H+2H + +4H +葡萄糖彻底氧化的总结算葡萄糖彻底氧化的总结算l 合成合成1个个ATP分子是由分子是由3个个H+通过通过ATP合酶所驱动合酶所驱动。多。多余的余的1个个H+用于将用于将ATP从基质运往膜外溶胶从基质运往膜外溶胶(合成合成1个个ATP分子实际是由分子实际是由4个个H+完成完成) 。 这样，这样，1分子葡萄糖彻底氧化成分子葡萄糖彻底氧化成 CO2时所得到的时所得到的ATP分分子数和过去传统的统计数（子数和过去传统的统计数（38或或36）相比少了）相比少了6个，即个，即32或或30个。个。 在在肌肉、神经肌肉、神经等组织中，通过等组织中，通过甘

24、油甘油-3-3-磷酸穿梭磷酸穿梭途径，途径，进入进入FADHFADH呼吸呼吸链链；在；在心、肝心、肝等组织中，通过等组织中，通过苹果酸苹果酸- -天冬天冬氨酸穿梭氨酸穿梭途径，进入途径，进入NADH呼吸链。呼吸链。五五、柠檬酸循环的调控柠檬酸循环的调控l柠檬酸循环可以概括地看作来自两个方面的调控柠檬酸循环可以概括地看作来自两个方面的调控 (一一) 柠檬酸循环本身制约系统的调节柠檬酸循环本身制约系统的调节 (二二) ATP、ADP和和Ca2+对柠檬酸循环的调节对柠檬酸循环的调节 (一一) 柠檬酸循环本身制约系统的调节柠檬酸循环本身制约系统的调节l在柠檬酸循环中，虽然有在柠檬酸循环中，虽然有9种酶

25、参加反应，但在调节循环种酶参加反应，但在调节循环速度中起关键作用的可视为三种酶：速度中起关键作用的可视为三种酶： 柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶 异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶 -酮戊二酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶。l柠檬酸循环中酶的活性主要依靠底物提供的情况推动，并柠檬酸循环中酶的活性主要依靠底物提供的情况推动，并受其生成产物浓度的抑制受其生成产物浓度的抑制。循环中最关键的底物应推。循环中最关键的底物应推乙酰乙酰CoA、草酰乙酸草酰乙酸和产物和产物NADH。(二二) ATP、ADP和和Ca2+对柠檬酸循环的调节对柠檬酸循环的调节 l ADP是是异柠檬酸脱氢酶的异柠檬酸脱氢酶的变构促进剂变构促进剂，从而增加

26、了该酶，从而增加了该酶对底物的亲和力（降低异柠檬酸酶的表观对底物的亲和力（降低异柠檬酸酶的表观Km值）。值）。l 机体活动处于静息状态时，机体活动处于静息状态时，ATP的消耗下降，浓度上升，的消耗下降，浓度上升，对该酶对该酶产生抑制产生抑制效应效应。l Ca2+在机体内的生物功能是多方面的，对柠檬酸循环在机体内的生物功能是多方面的，对柠檬酸循环也间接的起着重要的作用，也间接的起着重要的作用，对异柠檬酸脱氢酶和对异柠檬酸脱氢酶和-酮戊二酮戊二酸脱氢酶都酸脱氢酶都有激活作用有激活作用。六、六、柠檬酸循环的双重作用柠檬酸循环的双重作用 柠檬酸循环是绝大多数生物体主要的分解代柠檬酸循环是绝大多数生物体主要的分解代谢途径，也是准备提供大量自由能的