微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

1、微量凯氏定氮法测定蛋白质含量姓名：葛照硕 【摘要】蛋白质（protein）是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。蛋白质是食品中重要的营养指标。各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。本实验采用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量。【关键词】微量凯氏定氮法 微量凯氏定氮仪 蛋白质含量一、 前言1、蛋白质含量测量方法从查阅的资料来看，目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法

2、、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（ Bradford）、Folin酚试剂法。凯氏定氮法蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。天然有机物的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。生物材料的含氮化合物分析测定主要是指蛋白质，核酸的含量通常是用定磷法或别的方法测定。蛋白质的含氮量几乎是恒定的，约在1516 %之间。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。双缩脲法(Biuret)双

3、缩脲(NH3CONHCONH3 ) 是两个分子脲经180 左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。Folin酚试剂法Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂，第二部分为Folin-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)。因此，反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应，在碱

4、性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物 (呈蓝色反应)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比关系。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25250g考马斯亮蓝法（ Bradford）Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465 nm 变为595 n

5、m, 蛋白质在11 000 g 范围内, 蛋白质色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。紫外吸收法蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm 处,其吸光度(即光密度值) 与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。2、凯氏定氮仪凯氏定氮仪是根据蛋白质中氮的含量恒定的原理，通过测定样品中氮的含量从而计算蛋白质含量的仪器。因其蛋白质含量测量计算的方法叫做凯氏定氮法，故被

6、称为凯氏定氮仪，又名定氮仪、蛋白质测定仪、粗蛋白测定仪。图1 改良式凯氏定氮仪1,2,3 弹簧夹，4 加样漏斗，5 进气口，6 反应室，7 夹套，8 冷凝管，9 出水口，10 进水口二、 实验目的 1、学习微量凯氏定氮法的原理。2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等）。三、 实验原理当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢元素转变成CO2和H2O，而氮元素转变成氨，并进一步与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为“消化”。消化时分解反应进行得很慢，需要加入硫酸钾以提高沸点（可由290提高到400），加入硫酸铜作为催化剂（其他氧化剂如H2O2也可）。消化

7、完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解放出氨。用水蒸气蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸（硼酸）溶液中，然后用标准盐酸溶液进行滴定，从而计算出含氮量。以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下：本法适用范围为0.21.0 mg氮，相对误差小于±2%。四、 实验材料与试剂（1）实验材料：食用面粉（2）实验试剂：浓硫酸30%氢氧化钠溶液克氏催化剂2%硼酸指示剂0.01M HCL（3）器材：改良式微量凯氏定氮仪 消化炉 消化管 铁架台 电子天平 50 ml容量瓶 锥形瓶表面皿移液管量筒酸式滴定管酒精灯五、 操作步骤与现象消化：准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升的凯氏烧

8、瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上。向另一烧瓶加入1ml水作空白对照。在每个烧瓶内加入硫酸钾硫酸铜混合物（克氏催化剂）少许，浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入100ml的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。蒸馏：洗涤仪器，蒸馏器洗净后，开放水龙头P

9、3，使水进入A室，水放至A室球部即可。取3个50ml的锥形瓶，各准确加入10ml硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复盖备用。加样：用吸量管吸取1ml消化液，细心地由漏斗D倾入蒸馏室，再用蒸馏水1毫升清洗漏斗。取一个盛有硼酸混合指示剂的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠5ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。蒸馏：用酒精灯加热（应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸3-5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形

10、瓶，随即将蒸馏器洗净。）样品及空白蒸馏：用吸量管分别吸取1ml样品和1ml空白按上述操作步骤进行蒸馏。滴定：蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L 盐酸标准溶液进行滴定锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。记录所用盐酸的量。六、 注意事项（1）本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量过高时，则应减少取样量或将样液稀释。（2）勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至烧瓶底部再放样：如固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。（3）消化之前检查凯氏定氮仪的气密性良好，后用蒸馏水清洗凯氏定氮仪，要充分清洗。（

11、4）消化过程中，消化的时间应该充分，确保消化完全，消化至溶液呈现透明的浅蓝色；加碱液后要迅速关闭进样口，防止反应放出的氨气逸出；火焰的温度要适当，太小加热过慢，太大容易导致溶液暴沸甚至从进气口溢出；用硼酸封住蒸馏管口，防止氨气逸出；加热应保持均衡，冷凝水流速控制均衡，防止出现倒吸。（5）消化后要将液体充分冷却，定容到容量瓶中备用。（6）收集完氨气后，应用蒸馏水将蒸馏管口清洗，以收集在管壁残余的氨气。（7）蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后移开酒精灯，绝不能先灭灯，否则吸收液将发生倒吸。（8）滴定的时候，要控制滴定的速度由

12、快到慢，准确判断滴定终点。（9）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。（10）混合指示剂在碱性溶液中呈兰绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。七、 数据处理计算：若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则：样品的总蛋白含量（克蛋白%）=A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。实验数据：第一次滴定第二次滴定空白组滴定V初（mL）3.702.101.40V末 (mL)15.7014.302.20V(mL)12.0012.200.80实验数据处理两次滴定中V的平均值是12.10mL，代入计算公式：总氮量=15.82%八、 分析与思考含氮有机物+H2SO4 CO2+SO2+H2O+NH31、写出一下各步的化学反应方程式:蛋白质的消化：氨的蒸馏：氨的滴定：2、分析凯氏定氮法测定样品蛋白质含量时误差的原因答：凯氏定氮仪测定蛋白质含量的误差来源