桔梗中β-D-葡萄糖苷酶的提取研究

1、桔梗中p - d -葡萄糖昔酶的提取研究朱学军黄晓故2,王昊i,梁铮二王虹'(1.吉林农业大学生命科学学院，长春130118；2 .长春中医药大学药学院，长春130118)摘 要:以|1项筒械转仟油水解对硝基苯船-u-h州灿8匐械mpnpg)释放的对俯基苹fift(pnp)的ht测 定。-的制前转活力为标腐 采用稀盐溶液提取怙梗中阮的的情什酬.通过电因素控制变址 法探究怙梗中阡葡商傩什怖的存在和活力质定了岐适提取温度为3s'：.时间为2 h.料液比为i: 2s,款浓度为0.20 movl0关键词：牯梗：0-的曲糖代酬；提取：对硝检苯的阡1)毗喘约曲熟件(pnpc)studay

2、on extraction of 阡glucosidase from radix ofplatycodon grandifloruumzhu xue-jun1 基金工程：吉林省中医药科技工程，顼目编号：20xx152 通信 朱学军.男，讲师.博士,主要从事生物催彳质化勺天然产物生物活性研究o e-iiuil： xj/hulu.r<lu.< n. huang xiao-wei2. wang hao1. ijang jing1. wang hong1(1. college* of life scicik'cis jilin .agncultural university. ch

3、angchun 13011&2. school of (jiamuic y. changchun liniversity of traditional chinese nwxlicinc. changchun 130118l.abstract：beta glurcirlaxc cnzxmc activity s眼 measured by following thr mlegsc of |>-nitr<>|)lirnol (pnh fmm p- nitiv|>hrnyl-p-d glucopyranosidc (pnpg) and p-glucosidase ac

4、tivity was used as index. p-glucoskli* wil、 exhucled rnun plity<<kl<>n gniiklifliiniuni by ihin sail m>luli(iii. on the imsis of singh* laelor rx|m*rimrnl, a frw main carlon* that nfhvm llw arlivily of p-gliwoidasr wrrr <lrtrnninr<l. tlir irmihs showed (hat the optimum condition

5、s weir : tcmp<(raturv i5°c. lime 2 h. solid-liquid ratio 1:25. salt conceniration 0.2 niol/lkeywordszmalyc'imlfin graimliflorik； p-glik'ckiil.istrxink'liniijp-nilniphtuiyl-p-d-glik'oiiyniiiosidr桔梗(latyaxion gnindiflm心)是桔梗科植物桔梗 的枯燥根，是传统中药常用药，具有止咳，平喘，排脓 等成效.'研究人员采用现代分析技术对桔梗

6、中小分子 进行了分析研究,发现桔梗中主要活性戒分为三站类 和黄酮类物质叫。b-d-箭萄斯日啊(ec32i.21)届于水解防类乂 称b-d-葡匐糖甘菊箭糖水解帆是一类生物大分子, 能够水解结合于末端非复原性的b-d-葡劫精昔键, 广泛存在于植物、微生物和动物细胞中*%因此本文 以牯梗为原料，以对硝基苯-bd-葡萄糖为底物测 定在提取过程中两活力的变化.对桔梗中。-d-葡匐 提取主要影响因素进行探索为中药约物在生 物大分子方面的研究提供参考g1材料与方法1.1材料原料桔梗(市告,新鲜桔梗室温通风枯燥粉仲.过40 目箭，备用)。试剂对硝基苯小-d-毗响葡萄mr(p-nilrophenyl-3- l)

7、-glucopyranosi<le. pnpg),上海旭硕生物科技有限公 司;对硝基苯酚(pnp),分析纯天津市每钿特化工有 限公司;其他试剂均为分析纯。仪器l5s紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有 限公司。1.2方法酶活力测定方法粗酣液的制务:在一定条件下.将怙梗粉末参加适 虽稀盐溶液浸提一段时间后，用定虽滤纸进行过滤， 收集滤液.即为粗两液。测定方法 山：吸取粗前液0.1 ml参加0.5mlph4.5缓冲液中，于37弋恒温水浴预热5 min,再参加 已预热的5 minol/l pnpg 0.4 ml,桁确计时30 min. 迅速放入沸水中水浴5 min.流水冷却至室温，吸取 0.

8、5 ml反响力参加1 mol/lna/xh溶液中.混匀室 温放置5 min,于405 nm处测()1)值.空白对照管中参加0.1 ml沸水处理使瓣失活， 按上述操作。试鸵中以每克桔梗粉未提取的总筋活力为纵坐 标作图。参照文献5,配制1 mmol/l对硝基苯酚溶液.然 后用 1 mol/l naicoi.分别稀释为 0.1.0.05.0.025. 0.0125.0.00625.0 p.mol/l(以蒸儒水为空白对照，在 405 nm波长处测定吸光值.以吸光值为纵坐标.对矶 基苯的的浓度为横坐标.绘制标准曲线。酶活力定义：在ph4.5 ,温度37笆,以pnpg为底 物，每分钟水解产生1 |imol

9、对硝基苯酚的酶量为1 个活力单位(u)。计算公式如下：a-cixvl-3()xk (1)中a ：陋活力单位(u/g单位质仙原料提取 液测定的割活力)；c涿:对应于标准曲线上的对硝基苯附的浓度；v小单位质量原料提取液的总体积；v反:用丁丽活力测定提取液的体积；30：反响时间，单位min提取温度对醯活力的影响分别在不同温度下，其他条件固定，提取一定时 间后，过滤，收集涯液，按照悔活力测定方法测定磨活 力.以温度为横坐标,演活力为纵坐标绘图.：提取时间对葩活力的影响分别在不同时间下,其他条件固定.进行提取.收 集滤液,按照酶活力测定方法测定的活力，以时间为 横坐标，酶活力为纵坐标绘图。提取料液比对菊

10、活力的影响分别按照不同原料质量与提取液体积的比值(血 v) 其他条件固定，提取一定时间后，过滤，收集滤 液,按照前活力测定方法测定前活力，以料液比为横 坐标，酹活力为纵坐标绘图。盐浓度对物活力的影响分别使用不同浓度的氮化钠溶液.其他条件固 定,进行提取,收集滤液按照解活力测定方法测定醯 活力，以时间为横坐标.醐活力为纵坐标绘图。2结果与分析eig.l the staiwlanl rune of pxp线性回归方程为.rj0.9998说明线性关系戍 好。2.2提取温度对傅活力的影响图2涅度对酶活力的影响fig.2 effect of temjx'raturr on activity of

11、 (j-glucosiclasf 由图2可知,赫活力在温度2535y之间随假设温 度的增加而增大；温度增加有利于酶的溶出.但是温 度过高会使障蛋闩变性，使解活力降低，在35t以后 海活力随着温度的升高而降低 结果说明，最适提取 温度为35o2.3提取时间对防活力的影响圈3时间对曲活力的影响fig.3 eltecl of lime on activity of p-gluco$idase2.1对硝基苯酚标港曲级的绘制对硝基苯酚曲线见图i由图3可知，解活力在时间0.5-2 h之间随假设时 间的延k血增加;在提取时间2 h处海活力最高，提取 时间23 h酶活力迅速下降从结果可知,提取最正确时 何为2

12、 h.提取时间短葡箭糖件沌溶出量较低.提取 时间过长前容易受到细菌污染.蛋白前水解和其他导 致前变性物理i月素的影响，使的蛋日变性同时伴随着 前活力降低 > 结果说明，最适提取时间为2 h2.4提取料液比对此活力的影响1:191:26料液比(tn/v)1:33图4料液比对而活力的影响fi 务4 effect of sol id-liquid ratioon activity of p-gluco>i<lase 由图4可知.酶活力随假设料液比的增加而增大, 通过前活力的比拟砰知35料液比衙活力最多，但 是由于料液比增加酶活力增加幅度并不大,从经济原 姻上看.选择1：25作为最正

13、确提取的料液比， 2.5盐浓度对阳活力的彩响一 一- - o1 0 9 8 7 63 3 2 2 2 2 很活力u图5盐浓度对酶活力的影响eig5 eltrct of sal i ionccnt rat ion on acl i v i ty of (i-gl ucosidasc 由图5 “r知，盐浓度对阡葡匐糖开稿而活力影 响比拟大.盐浓度在0.05-0.2 nw/1,之间前活力随着 盐浓度增加而增加.主要是盐溶作用增大.盐浓度在 o.2-o.3 mol/l之间随假设盐浓度的增加而减少,这是由 于盐析作用增强而引起解活力的降低。从结果可知, 提取最正确盐浓度为0.2 mol/l3结论通过单因

14、素控制变虽法，使用稀盐溶液提取b- 葡匐柄样丽的技适条件:提取温度35t.提取时间2 h.料液比1:25.4k浓度为0.2 mol/lo参考文献1|朱继孝僧金祥,张亚梅.等.不同产地枯梗钺咳 弟疚作用比拟研究j|.世界科学技术-中医药现代化, 20xx7(05 ):976-980.|2|梁仲远.桔梗水提液的菜咳、盘痰作用研究儿 中 0 药房,20xx,22(35):3291-3292.3黄樱.史春蕾，刘墨祥，等.枯等灵樵浆粮咳、袪痰 作用的研究j|.扬州大学学报(农业与生命科学版), 20xx.29(04):42-44.|4|刘晓壮，张远林，繁华，等.b-葡萄糖昔与在酒 类酿造中研究进展j.中

15、国酸造,202x,39(6):8-12.(5) bronnrnmcier k, staudcnl>aurr w l purification and properties of an extracellular p -glucosidase from the cellulolytic thermophile clostridium slercorari- um|j|. appl microbiol biotechnol, 1988, 28:380-386.|6| witte k wartcnixrg a. purification and properties of two。-chieo

16、sidasrs isolated fnnn asjx'rgillus nigeijj. acta biotechnol. 1989,9(2): 179-190.7 srivastava s k, gopalkrishnan k s, ramachan- dran k b. kinetic characterization of a crude p-d-glu- cosidasr from aspergillus xvrntii pl 2804 j|. enzyme microb. trclinol 1984. 6:508-512.|8jsemenova m v, morozova v v . zorov i in , et al. illation and properties of fungal p -glucosidases |j|. 20xx. 74(5)： 5