乙型肝炎发病机理和抗病毒治疗的个性化

1、乙型肝炎发病机理和抗病毒治疗的个性化 慢性乙型肝炎（以下称慢乙肝）治疗路线图为临床医生合理应用药物提供了帮助，但其内涵重视了HBV在耐药性上的异质性而忽略了病毒在致病性上的异质性，将HBVDNA作为唯一用于指导治疗的指标。病毒以准种方式存在这一现象不仅阐明了病毒存在的群体结构和病毒进化的基础，而且对病毒的致病机制研究和控制病毒性疾病有关键性的指导作用。（1）病毒的异质性包括其基因型，野生株、变异株和准种，准种谱是每一个感染个体在感染过程中形成的，因此HBV病毒谱的差异也许更宜解释病毒性疾病在自然史、发病机制上和抗病毒治疗上的个体间差异。由于HBV发生变异的频率比其它DNA病毒高，因此HBV的异

2、质性对乙型肝炎的发病与治疗就显得更为重要。本文从HBV的异质性、慢性乙型肝炎的发病机制、慢性HBV感染病毒特性以及抗病毒药物作用与耐药机理为基点，对慢乙肝的临床处理提出一些思考。  一HBV的异质性的概念：1准种（quasispecies）：病毒基因型是在感染宿主群体中长期变异积累形成的，是相对稳定的。准种是指某株病毒在复制过程中，在同一宿主体内因变异所产生的异质性。HBV感染个体后在相对较短的时间内，HBV基因序列即以有微小差别的种群出现, 这种差别一般不会超过核苷酸总长度的25%，一般不导致病原体不同的基因型或血清型，这种基因序列的差别的现象称为准种。准种概念强调了病毒

3、复制中核酸错配的普遍性和病毒以微小差别的种群存在的特殊生物学模式。（1，2，3）HBV慢性感染时在经过一段时间内适应与选择的过程后形成相对稳定的种群，野生株（natural strain）由于在复制时间与空间上的优势，自然成为优势株。野生株一般可能是不致病的，表现为临床上所谓的免疫耐受期。随感染时间变化，野生株的优势地位可能被其它准种株或新出现的变异株所取代或部分取代。有的变异株可能带有与临床表现有关的显性特征，如高复制率、高感染力、致病性或耐药性等等，推测带有这些显性特征的变异株的出现在乙型肝炎发病机理与治疗中发挥了根本性的作用。2病毒池（virus pool）：一种病毒感染后在宿主体内以微

4、小差别存在的种群整体被称为病毒池，占多数的病毒株通常被认为是优势株，病毒池的准种谱是动态的。在内源性（宿主整体状况变化）和外源性（疫苗和抗病毒药物）的因素作用下，准种谱可能更容易发生漂移或出现新的变异株。新的病毒株要成为优势株必须要有可利用的复制空间（replication space），而原来优势株能否被取代则受病毒准种间复制率的竞争和肝细胞的更新率影响。耐药株通常是在敏感的病毒株（包括野生株）被抑制后获得增殖空间而发展的（4），选择性药物撤消后，被抑制的野生株是否重新出现，取决于残留野生株的数量和复制率与耐药株的竞争。目前尚无法检测肝内外的整个病毒池的病毒总量，但血清HBV直接来源于肝细胞

5、，血清HBV的半寿期仅为4小时（4），血清HBV载量可以间接反映近期肝组织内或病毒池的病毒总量和复制速度，因此血清HBVDNA的水平已经成为慢性HBV感染者临床诊断与治疗的重要检测指标。可以假设病毒池中与临床表现及治疗关联最密切最重要的就是野生株、致病株与耐药株，是慢性HBV感染时乙型肝炎发病机理与治疗研究的关键。3致病株（pathogenic strains）：HBV并不能直接导致肝细胞病变，或至少不具有高致病性。不少证据证明病毒性肝炎是由抗原特异性抗病毒细胞免疫及相应的细胞因子的应答造成的（5）。临床上可呈显形或阴性表现，很多研究表明慢性乙型肝炎患者存在与免疫系统相关的某种细胞或细胞因子的

6、异常表现，但慢性乙型肝炎患者似乎不存在系统性的免疫紊乱和功能异常，也很少伴其它免疫系统相关性疾病。近年来核苷类药物有效的抗病毒治疗可以阻止乙型肝炎肝组织损害这一现实也有力地否定了基于免疫系统紊乱或功能障碍的慢性乙型肝炎免疫发病机理，肯定了启动疾病的因素是HBV，免疫系统则参与了感染细胞的清除。因此慢性乙型肝炎的发病原因不是免疫系统及功能出现了本质性改变，而是病毒池中的病毒因变异而发生了质的变化，出现了致病的病毒株。致病株在病毒池中相对的比例与绝对值的变化直接影响慢性HBV感染者是否发病和发病后不同疾病谱。由于慢性肝炎患者免疫系统对HBsAg耐受，免疫攻击的靶抗原只能是HBcAg（6，7）。慢性

7、HBV感染者一般均存在强烈的抗HBcAg免疫应答，但一般情况下因HBcAg不含跨膜序列，仅位于感染细胞和病毒颗粒内而逃逸免疫攻击(4)，一旦HBcAg获得膜表达特性，由HLA限制的CD8+T细胞就可识别并攻击有HBcAg膜表达的感染细胞引发肝组织炎症反应(8)，因此慢性HBV感染者肝脏损害起始于具备HBcAg膜表达特征的致病株的出现。通过核酸与氨基酸序列分析研究，HBV的前C/C蛋白氨基端前19个氨基酸是疏水性的跨膜序列，此片段引导前C/C蛋白进入内质网腔后经内质网内的酶水解断裂，同时羧基端的34个氨基酸被细胞蛋白酶切割，分子重新折叠成为游离的HBeAg；前C/C基因易发生变异，如前C蛋白的酶

8、切段的氨基酸序列因变异造成跨膜序列不能正常断裂而使前C/C蛋白整体成为膜蛋白，即可将HBcAg的结构铆在膜上，成为免疫清除的靶抗原，导致相关免疫病理损害(6)。因此慢性HBV感染的致病株主要是具有HBcAg膜表达特征的病毒株。由于致病株受到免疫清除的强大压力，一般不易持续成为优势株，当致病株同时具有高复制和高感染扩散的特性时，可在一定时期内造成大量肝细胞损害，但感染细胞受损过程也是致病株被清除的过程，被溶解的细胞所释放出来的病毒核心颗粒由于被膜的缺如而无感染能力，又可被抗HBcAg应答清除，因此一般状况下随着致病株被清除，病情有缓解的时期。在核苷类抗病毒药物发明与使用前，临床上有相当部分的患者

9、在1-2次或数次肝炎发作后，在HBsAg和HBVDNA仍持续阳性的状况下，病情得到持续缓解，没有发展为肝硬化，研究这部分患者的体内病毒状态与临床转归对我们理解致病株的变化规律与抗病毒治疗的最终目标和治疗终点有重要的指导意义。临床上也有相当部分（15%-25%）慢性乙型肝炎患者肝组织持续损害而得不到缓解，最终进展为肝硬化，提示某些致病株存在躲避免疫系统而扩散的机制。4耐药株(drug resistant strains)：由于HBV病毒在复制中的高突变率，因此耐药株是可能在用药前先期存在的，因其可能被优势株的覆盖而未被表现。在抗病毒治疗过程中，由于药物敏感株被抑制，耐药的变异株获得复制空间，被选

10、择出来的可能性大大提高，但耐药株不一定是致病株，因此一般状况下不显示其特殊性，仅在抗病毒治疗状况下才突显其重要性。与致病株相比，单靶点作用药物耐药株出现的概率要高的多，因为致病株要导致显性病变，在有HBcAg膜表达变异的前提下，还需具备复制率与感染力上的优势，这涉及到多位点的复合变异，才可能与原先存在的优势株竞争获得相应的空间，导致肝脏损害与临床症状的出现。由于致病株本身也存在着在复制率、感染力和耐药性方面的准种差异，因此导致慢性乙型肝炎在肝脏病变、临床表现以及对治疗反应上的多样性。由于是涉及到多项功能改变的复合突变，概率要低很多，因此致病株致病现象的出现大多在慢性感染后几年或十几年后才出现，

11、而耐药株耐药可在用药几个月或几年即可出现。 进化理论认为，遗传突变有时会赋予物种新的生存优势，也就是说，相对于同类，携带了一些特殊遗传突变的生物体能更好地克服存在障碍，繁殖更多的后代。随着时间的推移，拥有优势突变的个体越来越多，占有群体中的主导地位，物种整体的表现与特征也出现了显性变化，因此物种的变异本质上不是突然出现的，有一个从量变到质变的过程。这种情况会一直持续下去，直到其它个体产生更具优势的突变，或环境发生改变，更有利于拥有其它性状的个体生存。总之，环境压力决定了生物群体的主流特性。据此分析“致病性突变”并不是一个优势突变，因为它将受到免疫清除的压力，必须配合以更高效的复制率、感染力变异

12、才有可能占据病毒池的优势地位，这也是致病株致病现象在感染时间较长后出现，出现的概率不高，乙型肝炎仅占慢性HBV感染者的一部分的理论依据；同时因受到免疫清除的压力，致病株优势地位往往不能持久，造成乙型肝炎在无抗病毒治疗状态下病程呈现反反复复的现象，相当部分患者康复后可得到持久缓解理论依据。临床上也有相当部分（15%-25%）慢性乙型肝炎患者肝组织持续损害而得不到缓解，最终进展为肝硬化，提示某些致病株存在躲避免疫系统而扩散的机制。二抗病毒治疗（一）持续抗病毒的困境 在相当部分的慢性乙型肝炎患者中，抗病毒治疗取得了明显的疗效，而中止治疗可使患者病情反复，因此国内外在乙型肝炎的治疗上均提出了持续抗病毒

13、治疗观念。2007年美国慢性乙型肝炎诊治推荐意见提出以HBeAg血清转换（HBeAg阳性患者）和HBsAg清除（HBeAg阴性患者）为参考治疗终点（9，10），而经核苷类药物治疗疗效反应主要是HBVDNA下降或伴随ALT下降，临床上这两种抗原转阴的比例并不高，这就使得大部分患者难以确定疗程与治疗终点。慢性乙型肝炎治疗路线图（Road map）（11）为临床医生合理应用药物提供了帮助，但其内含重视了HBV在耐药性上的异质性，忽略了HBV在致病性上的异质性，将HBVDNA作为唯一用于指导治疗的指标，在未阐明HBV与肝硬化及肝癌的内在机制状况下，将一种概率性结局作为规律性结局来防治，势必造成慢性HB

14、V感染者的扩大治疗与过度治疗，在一部分不需要干扰治疗的感染者中也干扰了HBV的自然感染过程，使抗药病毒株成为优势种群， HBV感染的防治将会变得更加困难。由于没有理想的慢性乙型肝炎实验动物模型，因此没有实验依据来论证核苷类药物的疗程，核苷类药物的药理作用是抑制病毒而非清除病毒，因此疗程的长短与停药后病毒复燃无关。即使在治疗过程中发生HBsAg和HBeAg的血清转换，也无法认定是核苷类药物的药理作用，因此基于HBsAg和HBeAg血清转换的持续用药方案缺乏理论依据。理论上持续核苷类药物使用诱导耐药株的发生是必然的（4），因此使患者将处于长期或终生用药、耐药与换药的困境。（二）病毒慢性感染的特征：

15、病毒慢性感染是由病毒在宿主的环境中长期逐步进化形成的，有一大类病毒一旦感染即可在体内长期存在，由于无细胞毒性，并不诱发疾病；或初次感染后激发免疫反应，临床表现急性感染过程，感染的病毒在免疫反应的压力下被局限化，但仍可在体内残留，如疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒等等。根据感染特征HBV应属于这类病毒。人类是HBV的唯一宿主，除活动性复制外，HBV也能以隐匿、休眠或整合状态而常驻细胞内，甚至在抗HBs存在状况下体内还可能有HBV基因组的残留，成为隐匿性感染(12)。尚未发现有进入细胞内识别抗原并清除病毒的机制，也未找到一种理想的清除细胞内病毒的自然或人工的药物。核苷类药物属于异单核苷或核苷酸，

16、可进入细胞干扰正常核苷酸的作用，其作用是广谱的，由于其可干扰逆转录病毒的逆转录酶序列，加上HBV病毒的复制更新率非常高，因此用药后可表现出病毒数量的快速下降，但其并不能清除细胞内的病毒颗粒与病毒基因，停药后细胞核内的HBV的cccDNA又可产生各类病毒mRNA而复燃，因此相应合理的后续治疗有待进一步研究。（三）合理的抗病毒治疗 抗病毒治疗在相当部分患者中可有效地抑制病毒复制，控制肝脏的炎症反应；由于HBV病毒存在致病与耐药上的异质性；肝细胞的损害是针对感染细胞病毒抗原特异的免疫应答所致，感染细胞损害伴随着病毒的清除；体内的HBV就整体来说是不可清除的。根据以上认识，建议将抗病毒治疗控制在合理的

17、范围之内，避免过度治疗。同时在临床上应有相应确实可行的诊断与疗效观察的指标，以确保现阶段治疗方案的可行性与可操作性。由于血清HBV的半寿期很短（4），因此血清HBVDNA变化基本反映了体内HBV病毒池的总量变化。ALT水平作为肝脏状况一个重要的生化指标可动态反映肝细胞的受损数量和肝组织的炎症程度，肝组织损害与致病株的绝对量相关，因此也间接地反映了病毒池中致病株的数量。病毒池总量与致病株绝对量的消长可能是慢性乙型肝炎抗病毒治疗上实施个性化的依据。当慢性HBV感染者HBVDNA阳性而血清ALT正常时，表明HBV病毒池中占优势是非致病病毒株（包括野生株），不建议用抗病毒治疗，当ALT发生异常时，指示

18、致病株出现而导致肝细胞受损，新发生的病例一般不立即抗病毒治疗，因为随着致病株被免疫系统清除，病情有缓解的时期，这个时期大约是1-2月左右，在不抗病毒的一般支持治疗下，如肝功能仍持续损害，表明免疫系统不能有效地清除和控制致病株的发展，则可进行抗病毒治疗。当然这不包括暴发性肝炎，因其发病机制完全不同。由于致病株与病毒池病毒整体复制率与比例不尽相同，肝脏的损害程度仅与致病株的量相关，不同的HBV基因型患者的临床转归也有不同（13），因此血清HBVDNA量不一定反映肝脏的受损程度。当有效的抗病毒药物发挥作用时，血清HBVDNA量下降，致病株在免疫清除与药物的双重作用下随之下降，肝组织损害也得以控制，表

19、现为血清ALT恢复正常，达到抗病毒治疗的效果，一般患者在两个月的有效治疗下就可使病程得到缓解，此时患者将处于一种是否继续用药的选择，下一步病况的发展取决于停药或继续用药状况下病毒准种谱的变化；停药后理论上病毒将逐渐恢复复制，但病况是否复发取决于致病株和野生株复苏力的竞争，如低复制率的野生株占优势，则血清HBVDNA 和ALT可持续保持在正常范围；如高复制率的野生株成为优势株，则血清HBVDNA逐步上升而ALT仍持续保持正常，表明病毒谱又恢复到发病前状况，这两种情况都可使病情得到持续缓解，因此在野生株恢复优势后而ALT正常状况下再持续抗病毒治疗的必要性有待更深刻的论证。如停药后血清HBVDNA

20、和ALT很快上升，指示致病株复燃，病情复发，可立即恢复抗病毒治疗并考虑持续用药的方案。在持续抗病毒治疗中，如致病株发生耐药性变化，血清HBVDNA和ALT再发生异常，患者需要改用敏感的抗病毒药；如原先的野生株（非致病株）发生耐药性变化，则血清HBVDNA上升而ALT持续正常，此时可保持用药一段时间后确保野生株（非致病株）占优势地位后考虑停用抗病毒药物。（2008.2 陈国民）（1）Domingo E. Quasispecies theory in virology. J Virology Jan, 2002, p463-465（2）Kim H; Jee YM; Song&#

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