鸡胚胎肌肉细胞中MC1R基因敲除研究

1、安徽大学安徽大学本科毕业论文（设计）本科毕业论文（设计）题题目：目：鸡胚胎肌肉细胞中鸡胚胎肌肉细胞中 MC1R 基因敲除研究基因敲除研究 学生姓名：学生姓名：廖廖 鹏鹏 学号：学号： D01014038 院（系）：院（系）： 生命科学学院生命科学学院 专业：专业： 生物科学生物科学 入学时间：入学时间： 2010 年年 09 月月导师姓名：导师姓名：刘大海刘大海 职称职称/ /学位：学位： 教授教授 导师所在单位：导师所在单位： 安徽大学生命科学学院安徽大学生命科学学院 毕业论文（设计）提交时间：毕业论文（设计）提交时间： 二二一四一四 年年 六六 月月I鸡胚胎肌肉细胞中鸡胚胎肌肉细胞中 MC

2、1R 基因敲除研究基因敲除研究作者：廖鹏 安徽大学生命科学学院 2010 级生物科学专业，230601指导教师：刘大海 安徽大学生命科学学院，230601摘摘 要要目的：目的： 建立鸡胚肌肉细胞 MC1R 基因基因敲除细胞系（+/-） ，为进一步在体内进行 MC1R 基因功能研究打下基础。方法方法： 设计 CRISPR/Cas9 基因敲除载体 sgRNA 片段，构建基因敲除载体，转染鸡胚胎肌肉细胞，通过 G418 药物筛选和单细胞克隆技术获得细胞系，测定基因突变情况。结结论：论：鸡胚胎肌肉细胞采用脂质体转染效率不高，下一步可以考虑采用慢病毒包装质粒转染； G418最适宜筛选浓度为 500g/m

3、l；实验获得杂合突变细胞系 12 个，下一步可将该技术用于动物实验。关键词：鸡胚；肌肉细胞；关键词：鸡胚；肌肉细胞；MC1RMC1R 基因；基因；CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9 基因敲除基因敲除IIthe research of MC1R gene knockout from chicken embryonic muscle cell Author: Liao Peng 2010 Bioscience Speciality, School of Life Science, Anhui University, Hefei, 230601 Advisor:Liu Daihai Sch

4、ool of Life Sciences, Anhui University, Hefei, 230601AbstractSubject: establish chicken embryonic muscle cell MC1R gene knockout cell lines (+ / -), lay the foundation for further study of MC1R gene function in vivo .Methods: design CRISPR/Cas9 knockout vector sgRNA fragment , construct gene knockou

5、t vectors, transfect chicken embryonic muscle cell, obtain cell lines by G418 drug screening and single-cell cloning technology , measure gene mutation. Conclusions: the efficiency of chicken embryonic muscle cells by liposome transfection is not high, the next step, we can use lentiviral packaging

6、plasmid to transfect; G418 optimum screening concentration is 500g/ml; the experiments obtain 12 heterozygous mutant cell lines, the next step , the technique can be used in animal experiments.Key words: chick embryo；muscle cells；MC1R gene；CRISPR/Cas9 knockout；III目目录录1 引言引言 .11.1 动物毛色决定基因的进展动物毛色决定基因

7、的进展 .11.2 鸟类毛色决定基因的进展鸟类毛色决定基因的进展 .11.3 MC1R 基因的进展基因的进展.21.4 CRISPR-Cas9 的进展的进展.31.5 研究的目的和意义研究的目的和意义 .42 材料和方法材料和方法 .42.1 实实验材料和实验仪器验材料和实验仪器 .42.1.1 实验材料实验材料 .42.1.2 实验仪器实验仪器 .42.2 实验方法实验方法 .42.2.1 主要试剂及配方主要试剂及配方 .52.2.2 细胞原代培养细胞原代培养 .52.2.3 细胞的冻存复苏细胞的冻存复苏 .62.2.4 CRISPR/Cas9 基因敲除载体基因敲除载体 sgRNA 的设计的

8、设计.62.2.5 CRISPR/Cas9 基因敲除载体的构建基因敲除载体的构建.62.2.6 利用利用 Cas9 质粒初步建立质粒初步建立 knock-out 细胞系细胞系.73 结果与分析结果与分析 .93.1 sgRNA 设计结果设计结果.93.2 PCR 验证阳性克隆电泳图片验证阳性克隆电泳图片.113.3 送检测序结果送检测序结果 .113.4 鸡胚胎肌肉细胞原代培养鸡胚胎肌肉细胞原代培养 .123.5 脂质体转染脂质体转染 .123.6 G418 药物筛选结果药物筛选结果 .133.7 基因敲除测定基因敲除测定 .134 结论与展望结论与展望 .13参考文献参考文献 .15致谢致谢

9、 .171鸡胚胎肌肉细胞中鸡胚胎肌肉细胞中 MC1R 基因敲除研究基因敲除研究1 1 引言引言1.1 动物毛色决定基因的进展动物毛色决定基因的进展动物的毛发、皮肤及眼睛的颜色主要由黑色素的数量、性质与分布情况控制的。黑色素(melanin)是脊椎动物表层结构中最主要的一种色素, 是一种不溶于水与几乎所有溶剂的无定型小颗粒, 存在于动物、植物和微生物中1。黑色素有两种: 一种是褐黑素, 是一种溶于碱的圆形红色颗粒, 表现出黄色和红色的毛色；另一种是真黑素, 包含黑色和褐色两种类型。动物毛色形成主要是由于毛囊黑色素细胞产生的真黑素和褐黑素两者之间的转换形成的。哺乳动物的黑色素合成由一个复杂的调控系

10、统控制, 在黑色素细胞的每一个发育水平都有几个相关的基因来调控, 反之, 同一个基因的产物在不同的发育阶段可能起到不同的作用。不同的肤色和毛色是由于基因的调节作用而改变了黑色素细胞色素的合成而导致的。控制毛色色素形成的遗传基因有 MC1R 基因（黑色素皮质受体 1，Melanocortin Receptor 1） 、Agouti 基因（鼠灰色基因，Agouti） 、TYR 基因（酪氨酸酶，tyrosinase） 、MITF 基因（小眼畸形相关转录因子，Microphthalmia- Associtated Transcription Factor）等等。MC1R 在决定真黑素与褐黑素的数量中起

11、着控制作用, 色素的形成通过黑色素细胞表面的受体即 MC1R 受体受到 a-促黑素细胞激素（a-MSH）的刺激2。Agouti 基因的表达会引起褐黑素的生成, 而 Agouti 不表达时则会引起真黑素的表达, 从而调节色素合成中真黑素和褐黑素两者之间的转换。据报道发现 Agouti 基因编码一种旁分泌信号分子即 Agouti 信号蛋白(ASIP，Agouti signaling protein), 使毛囊黑色素细胞合成褐黑素而不是真黑素3。TYR 是黑色素合成过程中的限速酶, 至少具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶2 种活性, 其活性高低决定着黑色素合成的种类与数量, 高水平的 TYR 活性导致真黑

12、素产生4。MITF 通过与酪氨酸酶基因家族启动子的作用, 一方面指导它们在黑色素细胞中的特异性表达, 另一方面参与外界刺激对黑色素细胞中黑素生成的调控5。1.2 鸟类毛色决定基因的进展鸟类毛色决定基因的进展鸟类的羽毛颜色与色素的分布、含量及比例有关。动物的羽色和毛色类型主要由黑色素的种类和分布不同造成6。前文提到，黑色素有两种：一种是褐黑色素，为溶于碱的圆形红色颗粒，表现出黄和红的毛色；另一种是真黑色素，包括黑色和褐色两种类型，比褐黑色素更难溶解，表现褐和黑的毛色7。许多相关的基因和酶在黑色素的合成及羽色的表达过程中起到了重要的作用。目前，研究较多的羽色相关基因主要有 MC1R 、TYR、Ag

13、outi 等等。MC1R 是动物毛色或羽色表型主要的调节基因。MC1R 由 extension 基因座编码，是最小的 G 蛋白耦合受体，长度一般为 310 多个氨基酸，其基因只有一个外显子，有 72个跨膜功能域，其天然配体为黑素皮质素激素肽8。MC1R 在黑色素细胞中表达，与天然配体 a-MSH 相互作用，通过由 G 蛋白耦合的 cAMP 信号通路，来调节黑色素细胞内的一系列级联反应，最终经多巴或多巴铬合成各自的衍生物即褐黑素细胞和真黑色素，从而在动物中呈现不同的毛色或羽色。TYR 其活性和表达量与两种黑色素合成量比例呈正相关9。TYR 是一种含铜的氧化还原酶，是动物体内黑色素细胞中黑色素合成

14、的限速酶10。TYR 催化酪氨酸氧化成多巴，进一步将多巴氧化成多巴醌，多巴醌再经过一系列生化反应最终合成黑色素。TYR 的功能反常会阻断黑色素形成的通路，动物往往表现白色表型11。Agouti 是一种旁分泌的信号因子，由黑色素细胞附近的真皮乳头细胞所分泌，作用于毛囊微环境，阻止黑素皮质素在 MC1R 处的作用12。Agouti 可以与 a-MSH 或促肾上腺皮质激素（ACTH）竞争性结合 MC1R，从而切断真黑色素的合成途径，并激活合成伪黑色素的反应途径。Agouti 基因的表达会引起棕黑素的产生，而其不表达时则会引起真黑素的生成，从而调节色素合成中真黑素和棕黑素两者之间的转换。1.3 MC1

15、R 基因的进展基因的进展MC1R 基因,中文名为黑素皮质素受体 1， 也称为促黑素细胞激素受体(MSHR) 基因, 是由扩散位点( extension locus, E) 编码的, 是控制动物黑色素合成的重要基因。MC1R 基因是控制动物黑色素合成的重要基因, 在黑色素细胞、肾上腺皮质细胞、神经系统和免疫系统中表现出不同的功能。MC1R 基因在哺乳动物中由 E 位点编码, 为 G 蛋白耦合受体- 黑素皮质素受体( melanocort inreceptors, MCRs) 的家族成员之一,只有一个编码区,其编码的蛋白质有 7 个跨膜结构域, 主要表达于动物的黑色素细胞中, 为G 蛋白耦合受体中

16、最小的一个13。MC1R 的两个配体分别为 a-MSH 与 ACTH , 它们与黑色素细胞膜上的 MC1R 结合后, 将与受体偶联的 G 蛋白从无活性的二磷酸鸟苷( CDP) 型转变成有活性的三磷酸鸟苷(GTP) 型, 激活细胞膜上的腺苷酸环化酶系统,将三磷酸腺苷( ATP) 转变为环腺苷酸( cAMP ) ,而 cAMP 进一步激活酪氨酸激酶, 从而活化 TYR。TYR 再催化黑色素细胞内的酪氨酸生成多巴, 多巴在黑素体内聚积到一定量后会释放黑色素, 若细胞中的 TYR 过量表达, 多巴及多巴醌会通过各自的通道来合成真黑色素； 反之, 酪氨酸则会转化为半胱氨酰多巴, 从而导致伪黑素的广泛表达

17、14。MC1R 基因是目前已知的黑色素基因中唯一一个能用来解释人类黑色素生成生理变异的基因, 人的红色毛发与 MC1R 等位基因的突变相关, 哺乳动物中该基因功能的丢失会造成红色或黄色毛发的生成。另外,MC1R 基因与人类癌症的形成也有关。Peng 等15在中国 4 个民族不同的人群中发现了 MC1R 基因突变共有 7 处, 其中有 5 处突变导致了氨基酸的改变。总之，MC1R 基因的变异与人的肤色、发色、皮肤癌等均有重要的关系。3哺乳动物中, 皮肤与毛发的颜色主要由毛皮中的真黑色素与脱黑色素的相对数量与分布状况决定。a-MSH 与 MC1R 结合引起 cAMP 水平的提高, 并且激发酪氨酸酶

18、水平的提高, 导致真黑色素的生成。结果表明, 在人、鼠、猪、马、犬、牛、绵羊及狐狸中都发现了 MC1R 基因的突变与黑色素性状变异和皮肤癌等疾病有关联。MC1R 通过控制真黑色素的数量来决定动物的毛色, 并与动物的疾病发生有关。随着研究的发展,MC1R 基因位点的全面检测也可能为动物品种资源的保存与利用提供重要的参考。1.4 CRISPR-Cas9 的进展的进展CRISPR/Cas9 系统是细菌在噬菌体长期的选择压力下进化出来的一种有效抵御外源DNA 入侵的免疫机制之一16。在菌体内，CRISPR 簇在其前导区的调控下转录成precrRNA17，并在 tracrRNA 和 Cas9 参与下加工

19、成成熟的 crRNA，引导crRNA/tracrRNA/Cas9 复合体识别结合外源 DNA 特定序列，剪切 DNA 双链，从而沉默外源基因的表达。鉴于此种原理，CRISPR/Cas9 系统被开发成了一种新型的基因打靶系统18。相对于较早的 Cre /LoxP、RNAi、ZFN 和 TALEN 系统，这种新型打靶系统具有操作简单、成本低、效率高、可同时沉默任意数量基因等优点。ZFN 和 TALEN 打靶技术是当前研究较成熟的 2 种定点突变技术，然而这 2 种技术有其缺点，其构建可识别特异位点的核酸酶较繁琐，每一个位点均需要构建 2 个相应的核酸酶，而 CRISPR/Cas9 系统对特异位点的

20、识别只要靠小的 crRNA 引导，CRISPR区可以由一系列的 crRNA 组成，且每个针对特异位点的 crRNA 只有几十个碱基，整个载体较小，比 ZFN 和 TALEN 载体更加容易构建。每一串 pre-crRNA 中均含有多个可对应不同 DNA 识别位点的序列，而 Cas9 可以通用，因此即使同时针对多个不同位点打靶，也只需构建一个载体即可19。目前 Jinek 等发明了一种更为新型的 CRISPR/Cas9 系统，将 crRNA 和 tracrRNA 2 个序列用一个 4 碱基的连接环连接起来，构成一个全新的guide RNA，对比于野生型的 CRISPR/Cas9 系统，这种新型的系

21、统更加容易构建，且具有相同的打靶效率20。作为一种新型打靶技术，CRISPR/Cas9 在构建和使用时简单、方便，成本较低，由于其可以同时对多个基因进行打靶，可以用来逐条甚至批量检测人类或动物基因组中的基因表达情况，从而明确基因的功能及调控网络；因为其打靶精确而高效的，还可以将其应用于人类的基因治疗、新药开发等生物医学研究领域，针对当前人类所高发的疾病( 癌症、传染病、遗传病等) 开辟新的治疗途径，并且为临床上的个性化治疗提供便利。另外，CRISPR/Cas9 发挥活性作用的核心部件为 sgRNA 和蛋白质，所以可以通过构建载体，体外转录获得 RNA，显微注射动物的受精卵从而获得打靶动物，而且

22、在整个打靶过程中不存在外源 DNA 的整合问题，因而避免了传统转基因导致的生物安全问题。所以 CRISPR/Cas9 介导的打靶系统在动植物新品种的培育中，尤其是转基因动物中，4也会有很大的作为。1.5 研究的目的和意义研究的目的和意义MC1R 通过控制真黑色素数量来决定动物的毛色, 并影响动物的疾病发生。目前在鸟类上关于其基因敲除及相关功能研究尚未见报道，本研究通过 CRISPR/Cas9 双切口基因敲除系统，对鸡胚胎肌肉细胞中 MC1R 基因敲除研究，进而为 MC1R 基因功能分析提供实验用细胞株，并为进一步应用于 CRISPR/Cas9 基因修饰转基因鸡个体研究打下基础。2 2 材料和方

23、法材料和方法2.1 实验材料和实验仪器实验材料和实验仪器2.1.1 实验材料艾维茵肉鸡胚胎肌肉组织2.1.2 实验仪器PCR 仪 LightCycler96，移液器 eppendorf，CO2培养箱 thermo、生物安全柜thermo，超净工作台苏州净化，凝胶成像分析仪 clinx，水平电泳槽 DYY-6C 型，电泳仪DYY-6C 型，荧光显微镜 OLYMPUS-DP70, 倒置显微镜，恒温水浴锅 HWS12 型，制冰机，冰箱 MEDIA，超低温冰箱 MEDIA。2.2 实验方法实验方法2.2.1 主要试剂及配方2.2.1.1 细胞培养试剂：培养液 DMEM/F12、培养液 1640、胎牛血

24、清(FBS)、胰蛋白酶、双抗均为 Gibco 公司产品；G418 为 Merk 公司产品；细胞培养其它相关化学试剂均购于 Sigma-Aldrich 公司；脂质体 Lipofetamine 2000 购自 Invitrogen 公司；QIAprep Miniprep Kit(50)质粒小提试剂盒购自 QIAGEN 公司；细胞培养用的耗材购自 Nunc 公司；dNTP Mix 购自美国Fermentas 公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase 购自 Takara 公司；GeneRuler 100bp DNA Ladder 购自美国 Fermentas 公司；GeneRule

25、r 1kb DNA Ladder 购自 Fermentas 公司；内切酶 Xho购自 Takara 公司；内切酶 Hpa购自 Takara 公司；不含干扰片段的质粒购自 cyagen 公司。2.2.1.1 细胞培养试剂配制：PBS 溶液(pH7.2)：NaCl 8g，N2HPO4 1.42 g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.27 g，溶于 1 L超纯水中。调节溶液 pH 值为 7.2，高压蒸汽灭菌，贮存于 4。DMEM/F12 培养液：取一小袋 DMEM/F12 培养基干粉用超纯水溶解后，加入 2.438 g NaHCO3，定容至 1 L，调 pH 值至 7.2，用 0.22 m 滤膜过

26、滤除菌，分装，贮存于 4。 5完全培养液：DMEM/F12 培养液 44 mL+胎牛血清 5 mL+双抗(1 万单位)1 mL。冻存液：70% DMEM/F12 培养液+20%胎牛血清+10%二甲基亚砜。无血清培养液：DMEM/F12 培养液 49 mL +双抗(1 万单位)1 mL。G418 筛选液：DMEM/F12 培养液 50 mL+25mgG418。2.2.2 细胞原代培养取孵化至 10 日龄的艾维茵肉鸡胚胎肌肉组织，放入含双抗的 PBS 溶液中，后浸人70%酒精 30-45 s 洗净，然后放入各含有 500 单位/mL 青链霉素的 PBS 中。肌肉组织用剪刀切成约 1 mm3的小块，

27、先用 PBS 清洗 1 次，再用 5 ml DMEM/F12 培养液清洗 1 次，用 5ml 胰酶 37消化 10 分钟。弃掉消化用胰酶，用八十目的细胞筛过滤，以去除未消化的组织块或大的细胞聚集团， PBS 清洗一遍后再加完全培养液 5ml，再将组织块均匀的接种于 25 cm2的细胞培养瓶内，第 2 天更换完全培养液，以后每 2 天更换一次培养液，至细胞面积覆盖达到 80%进行传代（第 5 天） ，弃培养液，用 PBS 冲洗 1 次，加入 0.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化 2-3min，加 1 mL 10%FBS 完全培养液终止消化。2.2.3 细胞的冻存复苏2.2.3.1 细胞冻存对实验

28、暂不需要的细胞进行冻存。当细胞从组织块中长出汇合度达 70%-80%时，弃培养液，用 PBS 冲洗 1 次，加入 0.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化 2-3min，加 1mL 10%FBS完全培养液终止消化，将细胞收集在 15 mL 离心管中，室温 1000 r/min 离心 4 min，弃培养液，用预冷的冻存液重悬细胞，封装至冻存管进行冻存，冻存程序为 4，30 min，用少量棉花包裹冻存管-80过夜，液氮中长期保存。2.2.3.2 细胞复苏将冻存的细胞从液氮中取出，迅速放入 37水浴，不断摇动冻存管加速融化。将融化的细胞冻存液移入 15 mL 离心管内，加入 8 mL 完全培养基(前面的

29、 4mL 要缓慢的加入)，离心 1000 r/min，4 min，弃去上清，加入适量完全培养基轻轻吹打细胞，移入 25 cm2培养瓶内，使细胞密度为 1106，加完全培养基 5 mL，置 37、5% CO2培养箱内培养。2.2.4 CRISPR/Cas9 基因敲除载体 sgRNA 的设计鸡 MC1R 基因的敲除质粒对如下：pYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-L2-SV40-NeopYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-R2-EF1a-eGFP根据鸡 MC1R 在 NCBI 或 ENSEMBLE 中所报道的序列信息进行查找。找到该基因 CDS 区，分析相应的基

30、因组结构，明确 CDS 的外显子部分。根据 MC1R 基因结构及功能特点确定待敲除位点，确定待敲除位点后，选择 23 至 250bp 的外显著子序列输入6到在线的免费设计 gRNA 的软件 Input 框中，然后进行设计运算，软件会自动输出gRNA 序列。并根据设计生成的 2 个 sgRNA，设计并合成对应的 2 对引物 Oligo 如下：MC1R-gRNA Oligo 序列： F-MC1R-gRNA-L1：CACCGAAGGAGAGGGAGGACACGA R-MC1R-gRNA-L1：AAACTCGTGTCCTCCCTCTCCTTCC F-MC1R-gRNA-R1：CACCGCTTCCTGG

31、GGGTCATCGCCG R-MC1R-gRNA-R1：AAACCGGCGATGACCCCCAGGAAG 2.2.5 CRISPR/Cas9 基因敲除载体的构建2.2.5.1 引物退火：1ul F-Oligo（100uM） ，1ul R-Oligo（100uM） ，8ul YSY oligo 退火缓冲液，以上溶液混合于 PCR 管内，在 PCR 仪中以每分钟 1.5逐渐从 95降至 22。2.2.5.2 连接：0.5ul 退火产物，1ul T1ul YSY 线性化三合一 CRISPR/Cas9n 质粒，1ul T4 连接酶，2ul 5*T4 Buffer，5.5ul Milli Q。2.2.5

32、.3 转化：室温 15min 后用大肠杆菌 DH5a 感受态细胞（pfu108）进行转化。2.2.5.4 转化子验证：转化涂板后挑取单克隆进行 10ul 体系菌液 PCR 验证。0.5ul 菌液，0.5ul YSY 验证正向引物，0.5ul R-Oligo，5ul Mastermix，3.5ul Milli QPCR 反应条件：Seg1：95预变性 2mim；Seg2：94变性 30s；Seg3：56退火30s；Seg4：72延伸 30s；Seg2 to Seg4 运行 35 个循环；Seg5：72再延伸10min；Seg6：4保存。2.2.6 利用 Cas9 质粒初步建立 knock-out

33、 细胞系2.2.6.1 细胞转染转染前一天，将细胞以 0.5-1.0106接种于 6 孔板中，根据实验需求设置 3 个组别：基因敲除质粒组、仅加入脂质体组和正常培养的阴性对照组，培养基换成不含抗生素的完全培养基，待第二天细胞汇合度至 70%-80%，即可以转染细胞。用 250 L 无抗生素无血清的 DMEM/F12 分别稀释 4 g PYSY 基因敲除质粒，10 L Lipofectaminetm 2000 脂质体。单独混匀后于室温放置 5 min。分别将质粒和脂质体混合，室温放置 20 min；同时将 6 孔板中的细胞培养液换为无抗生素无血清培养基。将上述质粒和脂质体的混合液加入 6 孔板中

34、，上下左右温和的混匀，放置 CO2培养箱中继续培养。转染 6 h 后，将培养液换为完全培养基。于 37，5% CO2培养箱内继续培养 24h 后取出细胞。转染后细胞形态观察：用 Olympus 荧光倒置显微镜观察细胞形7态和转染效率，选择合适的视野进行显微摄像。 2.2.6.2 G418 药物筛选及突变率检测G418 的配制：取 1g G418 溶于 1ml 1M 的 HEPES 液中，加蒸馏水至 10ml，过滤消毒，4 度保存。细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6 小时左右开始加药。制备筛选培养基：选择 400ug/ml、800ug/ml、1000ug/

35、ml 按梯度浓度用培养基稀释G418 制成筛选培养基。加 G418 筛选：吸除培养孔中培养基，PBS 洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每 35 天更换一次筛选培养基。确定最佳筛选浓度：根据细胞生长状况选择最佳筛选浓度。.基因组 DNA 提取：将发生转染的细胞经胰酶消化后，提取基因组 DNA 用作 PCR 模板。PCR 扩增目的片段：扩增含目标片段 DNA 的引物设计扩增后的 PCR 产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳，进行和 T-载体进行连接。转化及菌液 PCR：然后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。次日在 LB 琼脂平板上，挑取单克隆 50 个，溶于

36、 20ul LB 液中，涡旋后，将部分菌液接种到 LB 液中，37oC 下 250 rpm 生长，另部分的菌液用作模板进行快速 PCR，PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶电泳确定是否有条带，然后将大小相近的 10 个 PCR 产物等比例混合后，送商业公司测序。突变效率估测：人工阅读测序色谱图，估算突变效率。2.2.6.3 有限稀释法获得单克隆细胞胰酶消化，制成 5ml 细胞悬液。取 10 微升经细胞计数，得到 80,000 个细胞数/ml后，取 25l（内含 2000 个细胞） ，稀释并调整至 2000 个/ml。再稀释成 10ml 培养液。取 1ML 第 1 个稀释度的 cell 悬液加 9ML

37、 培养基。取 3ML 第二稀释度的 cell 悬液加7ML 培养基，将第三个稀释度的 cell 铺 1 块 96 孔板。每孔加 0.1ml。共加 96 孔。大约得到 0.6 个细胞/孔。将获得的单细胞培养 15 天后提取细胞 DNA，PCR 测序，具体方法同上。3 3 结果与分析结果与分析3.1 sgRNA 设计结果设计结果3.1.1 基因的基本信息 83.1.2 CDS 序列 3.1.3 蛋白质序列 其中，红色加粗的 M 为所选突变位置前的 M（在此之前的移码突变形成的突变等位基因可能会以该 M 对应的 ATG 作为新的起始密码子） 。3.1.4 蛋白质的保守功能结构域 3.1.5 基因组结

38、构 9M 2 3 4 5 6M 2 3 4 5 63.1.6 sgRNA 设计 将 sgRNA 识别位置设在 7tm_1 相对应的位置上（60aa 之后或总 120aa 以后） 细胞内在 U6 启动子驱动下预计的 sgRNA 转录本 RNA 序列分别为：MC1R-gRNA-Lg1MC1R-gRNA-Rg13.2 PCR 验证阳性克隆电泳图片验证阳性克隆电泳图片图 1 PCR 验证克隆电泳图片示例（Marker：Trans 2K Plus DNA Marker，从下到上依次为 100bp, 250 bp, 500bo, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp；2 为阴性对照

39、；3-6 为 MC1R-gRNA-Rg1 克隆）Fig.1 Verified cloning electrophoresis sample pictures（Marker：Trans 2K Plus DNA Marker，From bottom to top followed by 100bp, 250 bp, 500bo, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp；2 is negative control；3-6 is MC1R-gRNA-Rg1 clone）图 2 PCR 验证克隆电泳图片示例（Marker：Trans 2K Plus DNA Marker，从下到上依

40、次10为 100bp, 250 bp, 500bo, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp；2 为阴性对照；3-6 为 MC1R-gRNA-Lg1 克隆）Fig.2 Verified cloning electrophoresis sample pictures（Marker：Trans 2K Plus DNA Marker，From bottom to top followed by 100bp, 250 bp, 500bo, 750 bp, 1000bp, 3000bp, 5000bp；2 is negative control；3-6 is MC1R-gRNA-L

41、g1 clone） 3.3 送检测序结果送检测序结果 将之前验证正确的阳性克隆菌液送至金斯瑞生物技术有限公司测序，测序部分序列比对结果具体如下： pYSY-CMV-Cas9n-U6- MC1R-gRNA-L2-SV40-NeopYSY-CMV-Cas9n-U6- MC1R-gRNA-R2-EF1a-Egfp通过以上序列比对，可确定 2 个目标质粒构建成功。鸡 MC1R 基因的敲除质粒对：pYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-L2-SV40-Neo 质粒：4ug 浓度:190ng/ulpYSY-CMV-Cas9n-U6-MC1R-gRNA-R2-EF1a-eGFP 质粒：4ug

42、 浓度:184ng/ul3.4 鸡胚胎肌肉细胞原代培养鸡胚胎肌肉细胞原代培养图 3 细胞原代培养（10X10）Fig.3 Cells in primary culture（10X10）图 4 传代培养细胞（10X10，转染前）Fig.4 subcultured cells（10X10，before transfection）113.5 脂质体转染脂质体转染3.6 G418 药物筛选结果药物筛选结果3.7 基因敲除测定基因敲除测定图 5 转染后胚胎肌肉细胞（荧光下，10X10）Fig.5 embryonic muscle cell after transfection(under fluores

43、cent，10X10）图 6 转染后胚胎肌肉细胞（10X10） Fig.6 embryonic muscle cell after transfection（10X10）图 7 对照组（10X10）Fig.7 control group（10X10）图 8 G418 筛选一周后细胞（10X10）Fig.8 G418 cells after a week（10X10）12测序结果经初步分析，其突变率约在 15-30%之间，进一步挑选单克隆细胞系 40 个，经测定发现有突变的细胞系 12 个，部分细胞测序结果如上图所示。实验所获得突变细胞系均为杂合型突变（+/-） 。4 4 结论与展望结论与展望本

44、研究中，鸡胚胎肌肉细胞采用脂质体转染效率不高，下一步可以考虑采用慢病毒包装质粒转染；在本研究中，G418 最适宜筛选浓度为 500g/ml；实验获得杂合突变细胞系 12 个，下一步可将该技术用于动物实验。利用 CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除已经成功应用于大肠杆菌、肺炎双球菌、酿酒酵母、斑马鱼、小鼠细胞、小鼠、人类多种细胞系、果蝇、线虫、大鼠、水稻、小麦、拟南芥以及本生烟中。AnimBiotechnol 中一篇文章中提到为了便于外源基因的定点整合入鸡卵清蛋白基因的 3-非翻译区，使用锌指联合体载体试剂盒构建的 ZFN 表达载体并测试了这些 ZFN 的功能构造并用来研究特定的 3非翻译鸡

45、卵清蛋白基因区域的功能。而 Genes toCells 中一篇文章中提到用 DT40 敲除和敲入技术研究决定鸡 Ig-b 基因所必须和足够的转录区和其表观遗传转化的情况。本研究所采用的 CRISPR/Cas 系统与以上报道相比，质粒构建与转染等均更为简便，MC1R 系毛色决定基因，在体外实验中不会表现出表型差异，下一步本研究将该技术应用于体内实验，深入研究该基因功能。13参考文献参考文献 Cone R D , ImS, Nordlund J,Malek ZA. Binding ofmelanotropic hormonesto the melanocortin receptor MCIR on

46、 human melanocytesstimulates proliferation and melanogenesisJ.Endoerinolog Y,1996, 137 (5) : 1627-1633.2 邓素华, 高军, 任军, 等. 黑素皮质素受体 1( MC1R) 基因与猪毛色表型的研究 J . 遗传学报, 2003, 30( 10) : 949 954.3 Matsunaga N, Virador V, Santis C, eta1. Insitulocalization of AgoutiSignal Protein in murine skin hsing immunohist

47、oc hemistrywith anASIP-specific antibody J. Biochemical andBiophysical ResearchCommunications. 2000, 270: 176-182.4 邓学梅. 用于鸡基因定位的资源群体的建立和黑色素等质量性状的遗传分析d.中国农业大学, 2001.5 白瑞, 张美萍等.MITF 基因与动物毛色的研究进展J.上海畜牧兽医通讯,2006(4):2-3.6 杨永升, 邓学梅, 李宁, 等. MC1R 是控制鸡黑色素形成的候选主效基因 J . 生物化学与生物物理进展, 2004, 31( 6) : 500 505.7 约

48、翰森 L，伦德尔 J.遗传学与家畜育种学M.上海：上海科技出版社，1982.8 KERJE S，LIND J，SCHUTZ K，et a1Melanocortin 1Receptor （MC1R）mutations are associated with plumagecolour in chickern J Animal Genetics，2003，34 （4）：241-2489 Jackson I J，Bennett D C. Identification of the albino mutation of mouse tyrosinase by analysis of an in vit

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