重组人胸腺素β4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测

1、重组人胸腺素b 4基因的克隆、表达、纯化、鉴定及活性检测【摘耍】0的：利用基因工程的方法原核表达重组人胸腺素0 4(tp 4)并对其进 行纯化和鉴定.方法：使用大肠杆菌偏爱密码子合成人tb4全长基1大i,构建了 t b 4的二串联体基因(t13 4),将其克隆入表达载体pef 22b(+)>|«,重组质粒转 化大肠杆菌bl21(de3)感受态,ip1g诱导表达后,经盐析、疏水层析和离子交换层 析纯化重组蛋白,釆用免疫卬迹和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对重组蛋 白进行鉴定.结果：获得了纯化的重组tb 4蛋白，并具有生物学活性.结论：成 功构建、表达和纯化了 tb 4，为其功能

2、研究奠定基础.【关键词】 胸腺索b4串联重复序列克隆分子基因表达0引言胸腺索b 4(thymosin beta 4, tb 4)广泛分布于各组织、器官和细胞中，与免 疫功能、神经发育和肌动蛋白功能密切，还可抗炎,促进血管生成门、创伤愈合2、毛囊发育3，修复受损的心肌4 虽然ti3 4有着广泛的应用前景, 但由于其分子太小，难于直接在大肠杆菌中表达.目前用于实验室及临床试验的 tb 4主耍为化学合成品，价格昂贵,使其应用受到限制.我们利用基因合成与pcr 技术,构建了 tb 4的二串联休基因(tb 4)表达载体，在大肠杆菌中成功地表达 和纯化了该串联体，为进一步的研究奠定了基础.1材料和方法1.

3、1材料质粒pet 22b(+),大肠杆菌dh5a及bl21(de3)由本中心保存; 人tb 4全长基因、测序(北京奥科生物技术有限责任公司);引物(上海英峻生物公 司);限制性内切酶nde i , bamh i , sal i ,14 dna连接酶以及dna marker dl2000(lakara);laq pcr mix(天根生化科技有限公司);b型质粒小量提取试 剂盒，小分子量dna片段高效快速回收试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限 责任公司);蛋白分子质量标准(fermentas);兔抗人tb 4多克隆抗体 (abeam,ab14334);hrp 山羊抗兔iggdab显色液(北京中杉

4、金桥生物技术 有限公司);ipt3,琼脂，琼脂糖,mtk北京鼎国生物技术有限责任公司)；phenyl sepharose 6 fst row(high sub), q sepharose fast row, kia purifier(pharmacia);cona(华美生物工程公司)，小鼠淋巴细胞分离液(天津颇 洋生物制品科技有限责任公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司), rpmi1640(gibco),tp4化学合成品(proec bny),其他试剂均为国产分析 纯;balbc小鼠，雄性,68周龄(第四军医大学实验动物中心).1.2方法1.2.1重组t3 4基因的克隆按照大肠杆

5、菌惯用密码了及人胸腺素b 4氨基 酸序列设计并合成了编码t0 4的全基因片段,5和3末端分别带有nde i和 bamh i酶切位点，将其克隆入pet 22b(+)中，nde i和bamh i双酶切鉴定 后，将其命名为pet 22b(+) tp 4;合成两条引物，上游引入bamh i酶切位 点，下游引入sal i酶切位点及终止密码子tag,以pet 22b(+) t0 4为模 板进行pcr扩增,pcr产物经bamh i和sal i双卿切后克隆入pet 22b(+)tb4中，bamh i和sall双酶切鉴定并测序,命名为pet 22b (+) tp 4 .1.2.2重组tp 4的表达重组质粒p e

6、t 22b (+) tp 4转化大肠杆菌 bl21qe3)感受态细胞,挑取阳性克隆接种于含氨节青霉素100 mg/l的lb培养 液中,37°c震荡培养过夜,(a)以1 : 100分别转接入六个试管中，继续培养2 h(a600 nm=0.5)后,其屮一管作为诱导的阴性对照，另五管分别加入终浓度为 0.01,0.05,0.1,0.5,1 mmol/l ip1g,继续培养 4 h,离心收集菌体行 sds page;(b)以1 ： 100分別转接入两个试管中，继续培养2 h(a600 nm=0.5)£/,m 中一管i乍为诱导的阴性对照，另一管加入终浓度为0.01 mmol/lipt

7、g,每隔1 h收 集菌体进行sds page1.2.3重组tb 4的western blot鉴定ip1g诱导及未诱导的bl21/pet 22b (+) tp 4行sds pag e,随后将其转移到nc膜上，用兔抗人tb 4多克 隆抗体作为一抗,hrp 山羊抗兔igg作为二抗，进行western blot鉴定.1.2.4重组tb 4的纯化终浓度为0.01 mmol/l的ipt3，诱导bl21/pef 22b(+) tb44 h后收集菌体,超声裂菌后的上清经硫酸鞍盐析、phenyl sepharose 6 fst flow(high sub)疏水柱和 q sepharose fast how 阴离

8、了交 换柱纯化后,lowrys法测定蛋白含量.1.2.5maldi 7of ms和hplc将纯化后的重组tb 4透析在水小,0.22 u m滤膜过滤除菌后，委托军事医学科学院仪器测试分析中心对其进行分子量测 定.另取20 ul样品进行hplc分析.1.2.6重组tb 4的生物学活性检测从小鼠单个脾细胞悬液中分离淋巴细胞, 用含100 ml/l胎牛血清的rpmi1640调整细胞浓度，加入cona使其终浓度为 2.5 mg/u按每孔4x105细胞加入96孔细胞培养板屮,37°c孵箱培养6 h后，加 入重组tb4和tb4化学合成品，终浓度分别为2,4,8 umol/l,继续培养72 h,m

9、tt法测定淋巴细胞的增殖和分化.2结果2.1 pc r及酶切和序列鉴定人tb 4基因的pc r产物经0.2 g儿琼脂糖凝胶 电泳检测，在约135bp处可见特异性条带(图1),该片段大小与预测结果一致.分 别用限制性内切酶nde i和sal i ,nde i和bamh i , bamh i和sal i双酶切 pet 22b (+) tb4,在270 bp处可见重组t0 4基因及135bp处的tb4 基因片段(图2).测序结果为序列正确的重组tb 4基因，含起始密码子、终止密 码了及酶切位点.1: pcr产物;m: dna marker.图1人tp4pcr产物电泳图1:pef 22b (+) tb

10、4 /ndel 和 sal i 双酶切；2:pef 22b (+) tp 4 /nde i 和 bamh i 双酶切；3: pet 22b(+) tp 4(g)/bamh i 和 sal i 双酶 切；m: dna marker.图2人tb 4重组克隆的酶切电泳图22重组tb 4的表达sds page结果表明,各浓度ipt3诱导bl21/pet 22b(+) t0 44 h后，均有明显的新生条带岀现，其量无明显差别(图3)；终 浓度为0.01 mmol/l的ip1g诱导bl21/pet 22b(+) tb4不同时间后，同 样有明显的新生条带岀现，诱导4 h后其量明显增加(图4).m: mark

11、er; 1:未诱导 bl21/pet 22b(+) tb4；26: 0.01, 0.05,0.1,0.5 和 1 mmol/liptg 诱导 bl21/pet 22b(+) tp 4 4 h.图3ipt3浓度对重组tp 4表达的影响m: marker; 1:未诱导 bl21/pet 22b(+) tb4；27: 0.01 mmol/l ipt3 诱导 bi_21/pet 22b(+) tb 4 仆6h.图4诱导口寸间对重组tb 4表达的影响2.3重组tb 4的western blot鉴定dab显色后在相应位置有条带显现, 表明重组tb 4蛋白可与兔抗人tb 4多克隆抗体特异性结合(图5).1:

12、 0.01 mmol/l ipt3 诱导 bl21/pet 22b(+) tp 4 4 h; 2:未诱导 bi_21/pet 22b(+) tp 4; m: marker.图5重组tb 4的免疫印迹鉴定2.4重组tb 4的纯化超声裂菌可知重组tp 4蛋白以可溶性形式存在，经 硫酸较盐析、疏水层析和阴离子交换层析可得较高纯度重组tb4蛋门(图6), 平均每克菌约可得到7.5 mg tb 4蛋口纯品.m: m a rke r; 1:未诱导 bl21/pet 22b (+) tb 4; 2: 0.01 mmol/l i pig 诱导bl21/pet 22b(+) tp 44 h; 3:超声裂菌沉淀；

13、4:超声裂菌上清；5: 硫酸钱盐析沉淀;6:硫酸镀盐析上清;7:疏水作用纯化目的蛋口； 8:离子交换作 用纯化目的蛋白.图6重组tb 4的纯化2.5maldi tof ms和hplc质谱分析测得重组tb 4的mr为10 020.5,与理论分子量相近（图7a）;hplc测定其纯度大于95%（图7b）.2.6重组tb 4的生物学活性检测与对照相比，重组tp 4与商品化的tb 4 均可有效地刺激淋巴细胞的增殖和分化（表1）,这一发现证实我们获得了与商品 化tb 4活性相当的重组ti3 4.图 7 重组 tb 4的 maldi 1of ms （a）和 hplc （b）表1重组tb 4生物学活性检测浓度

14、（umol/l） o a 570 nmtp4 t b 40（对照）n 0.096土0.012 o 0.096±0.0122 o 0.135±0.013a o 0.127 ±0.010a4i3 0.158±0.016a k3 0.147土0.015a8 ku 0173±0.020a 0 0.166 ±0.017aap<0.05 vs 对照.3讨论虽然sds page是测定蛋白质分子量的一种简便易行的方法，但有些蛋白 质用这种方法测出的分了量是不可靠的.这些蛋白质有:电荷异常或构象异常的 蛋白质（组蛋片f1木身带有大量正电荷

15、，尽管结合了正常比例的sds仍不能完全 掩盖其原有正电荷的影响）;带有较人辅基的蛋口质（如某些糖蛋口）以及一些结构 蛋口（如胶原蛋口）和含二硫键较多的蛋口质（有些受体）5tb4的理论分子 量为10 000,但电泳结果显示其mr约为18 000,随后采用质谱分析对其分子量进 行测定，结果与理论分了量接近.tb 4电泳分了量与理论分了量的偏差可能是 由于其构象异常引起的，因为tp 4不带有辅基，并非结构蛋白,不含有二硫键，并 且可排除电荷异常（单体tb 4电泳分子量与理论分子量相符）因此，在分析sds page所得的结果时，应该用至少两种方法来测定未知样品的分子量.tp 4在胸腺素b家族中丰度最高

16、,它是肌动蛋白分离剂，参与很多重要的生 理和病理活动.目前，关于tb 4的临床试验包括压迫性溃疡、人疱性表皮松解症、 静脉淤积性溃疡、糖丿求病的玻璃体切割术和急性心肌梗死，其中前四项己进入ii 期临床试验此外,tb 4的异常表达与肿瘤转移关系密切6，对tb4进一涉深 入研究有助于找到治疗高转移肿瘤的有效疗法.虽然tb4有广泛的临床应用前 景，但目前所用的化学合成品价格昂贵，同时tb 4是小分了多肽，难于直接在大肠 杆菌中表达，所以其大规模生产受到限制.关于tb 4的融合表达已有报道：在tb 4的n端融合5个氨基酸（hkcdi）, 可以使tb 4在大肠杆菌得到高效表达,纯化后的蛋白可提高e玫瑰花

17、环结花率, 并可促进t细胞的增殖和分化7 ; tb 4融合蛋白在大肠杆菌表达后经亲和层 析和dtt水解,可得到c端融合5个氨基酸（leg田的重组tb 4,不仅可以促进淋 巴细胞的增殖和分化，而ii可以促进伤口愈合8;此外,his6 tb 4可在大肠杆 菌中高效表达并具有促血管生成的生物活性9我们利用串联重复技术在大 肠杆菌中成功农达了重组tb4,经过硫酸馁盐析、疏水作用和离子交换作用层 析，得到高纯度的重组蛋白,不仅具有生物学活性，也为下一步功能研究奠定了基 础.【参考文献】1 sfnart n, rossdeutsch a, rley p. thymosin beta 4 and angio

18、genesis: modes of action and therapeutic potential j angiogenesis, 2007,10:229-241.2 mali nd a km, 3dhu gs, mani h, et al. thymosin beta 4 accelerates wound healing j j invest dermatol, 1999,113(3):364-3683 philp d, nguyen m, scheremeta b, et al. thymosin beta 4 increases hair growth by activation of hair follicle stem cells j fasffi j, 2004,18(2):385-387.4 bock marquette i, saxena a, white md, et al. thymosin b4 activates integrin lin ked kinase and pro motes cardiac cell migration, survival and cardi