分子生物学与医学诊断ppt课件

1、分子生物学与医学检验分子生物学与医学检验医学检测技术进展医学检测技术进展Molecular Biology and Laboratory Medicine分子诊断学的开展分子诊断学的开展分子诊断学分子诊断学 以分子生物学实际为根底，利用分子以分子生物学实际为根底，利用分子生物学的技术和方法研讨人体内源性或外生物学的技术和方法研讨人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、构源性生物大分子和大分子体系的存在、构造或表达调控的变化，为疾病的预防、预造或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策根测、诊断、治疗和转归提供信息和决策根据。据。分子生物学与医学检验分子生物学与

2、医学检验历史回想历史回想常规技术常规技术边缘技术边缘技术未来开展未来开展历史回想历史回想KanKan等用液相等用液相DNADNA分子杂交技术胜利的进展分子杂交技术胜利的进展镰形细胞贫血症的基因诊断镰形细胞贫血症的基因诊断 检验诊断进入基因诊断时代检验诊断进入基因诊断时代分子诊断学的开展分子诊断学的开展分子诊断学的开展分子诊断学的开展 Polymerase Chain Reaction (PCR) 技术发表技术发表1990s 人类基因组方案人类基因组方案HGP启动启动1999 The journal of Molecular Diagnostics 出版出版分子诊断学的开展分子诊断学的开展三大阶

3、段：三大阶段：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断PCRPCR技术技术病原体检测及多基因遗传病病原体检测及多基因遗传病组学技术组学技术 The Age of The Age of “OmicsOmics 高通量密集型检测技高通量密集型检测技术术常规技术常规技术常规技术常规技术细胞程度细胞程度分子程度分子程度组学技术组学技术DNA免疫印迹免疫印迹ProteinELISAPCR测序测序流流氏氏细细胞胞仪仪各类各类Microarray常规技术常规技术基因构造异常基因构造异常基因表达异常基因表达异常蛋白质蛋白质m-RNADNA核酸分子杂交核酸分子杂交PCRDNA测序测序

4、逆转录逆转录PCRReal-time PCRNothern-blotWestern-blot蛋白质组织化学染色蛋白质组织化学染色ELISA分子杂交类型分子杂交类型分子杂交技术分子杂交技术DNA of various sizesElectrophorese on agarose gelgelDenature - transfer to filter paperblot分子杂交技术分子杂交技术Hybridize to probe Visualize分子杂交技术分子杂交技术细胞遗传学细胞遗传学产前诊断产前诊断病原体诊断病原体诊断PCRPCR 高灵敏度高灵敏度 高特异性高特异性 快速快速优优 势势PC

5、RPCRPCRPCR法检测乙肝的优势表如今：法检测乙肝的优势表如今： 早期诊断，由于早期诊断，由于PCRPCR扩增极其敏感，在感染埋伏扩增极其敏感，在感染埋伏期即可被期即可被PCRPCR法检出。法检出。 对低继续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人对低继续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，普通酶标试剂无法检出，可以用普通酶标试剂无法检出，可以用PCRPCR法检出。法检出。 疗效跟踪及病程判别，由于疗效跟踪及病程判别，由于PCRPCR能半定量检测乙能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒能否存在及其数量多少的最直肝病毒基因

6、，是病毒能否存在及其数量多少的最直接目的。在治疗过程中经过监测血清或白细胞中病接目的。在治疗过程中经过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。 Western-blot 原理原理: :在电场的作用下将电泳分别的多肽从凝胶在电场的作用下将电泳分别的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测抗体来检测Western-blot 蛋白样品的制备蛋白样品的制备 SDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 凝胶电泳凝胶电泳l转膜转膜l封锁封锁l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显

7、色底物显色流程流程新兴技术新兴技术新兴技术新兴技术 脉冲场凝胶电泳技术脉冲场凝胶电泳技术 流式细胞仪的新运用流式细胞仪的新运用脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳PFGEPFGE原理原理: : 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进展的，进展的，DNADNA分子在交替变换方向的电场中作出反分子在交替变换方向的电场中作出反响所需的时间显著地依赖于分子大小，响所需的时间显著地依赖于分子大小，DNADNA越大，越大，这种构象改动需求的时间越长，重新定向的时间这种构象改动需求的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳也越长，于是在每个脉冲时

8、间内可用于新方向泳动的时间越少，因此在凝胶中挪动越慢。反之，动的时间越少，因此在凝胶中挪动越慢。反之，较小的较小的DNADNA挪动较快，于是不同大小的分子被胜利挪动较快，于是不同大小的分子被胜利分别。分别。 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳PFGEPFGEThe size of DNA is 3050 kbThe size of DNA larger than50 kb脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳PFGEPFGEHow we separated the larger DNA fragments, such as chromosome?脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳PFGEPFGE原理原理: :细菌包

9、埋于琼脂块中细菌包埋于琼脂块中, ,用适当的内切酶在原用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进展酶切位对整个细菌染色体进展酶切, ,酶切片段在酶切片段在特定的电泳系统中经过电场方向不断交替特定的电泳系统中经过电场方向不断交替变换及适宜的脉冲时间等条件下而得到良变换及适宜的脉冲时间等条件下而得到良好的分别。好的分别。流式细胞仪流式细胞仪 流式细胞仪流式细胞仪(flow cytometer(flow cytometer，FCM)FCM)是进是进展流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计展流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体实际、细胞荧光算机技术、激光技术、流体实际、细胞荧光化学技

10、术及单克隆抗体技术于一体，被誉为化学技术及单克隆抗体技术于一体，被誉为实验室的实验室的“CTCT。 流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪Microbead流式细胞仪流式细胞仪A schematic illustration of using fluorescently microbeads 流式细胞仪流式细胞仪运用运用 细胞因子的结合检测细胞因子的结合检测 感染性疾病的结合诊断感染性疾病的结合诊断 研讨研讨RNARNA与蛋白质之间的相互作用与蛋白质之间的相互作用临床运用临床运用遗传性疾病的诊断遗传性疾病的诊断 Sickle-cell anemia镰状细胞性贫血镰状细胞性贫血 Cystic

11、Fibrosis囊性纤维化囊性纤维化 Alpha-1-Antitrypsin Deficiency - 1 -抗胰蛋白酶缺乏症抗胰蛋白酶缺乏症 Sickle cell anemia - backgroundSickle cell anemiaSickle cell anemiaDNA Hybridization 1 Normal (AA)2 Abnormal (AS)3 Abnormal (SS)感染性疾病的诊断和检测感染性疾病的诊断和检测莱姆病莱姆病感染性疾病的诊断和检测感染性疾病的诊断和检测伯氏螺旋体伯氏螺旋体PCR法检测法检测感染性疾病的诊断和检测感染性疾病的诊断和检测 厌氧菌、苛氧菌及

12、不能人工培育的病原体厌氧菌、苛氧菌及不能人工培育的病原体的鉴定的鉴定 治疗检测治疗检测 耐药基因的检测耐药基因的检测疾病的预测疾病的预测实验阐明：实验阐明： 氨基糖苷类药物诱发非综合征耳聋的分氨基糖苷类药物诱发非综合征耳聋的分子根底为线粒体子根底为线粒体DNADNA中中12S rRNA12S rRNA基因基因A1555G A1555G 突变和突变和 C1494T C1494T突变。突变。疾病的预测疾病的预测P53P53基因突变使细胞增值加速，假设同时基因突变使细胞增值加速，假设同时其等位基因丧失那么增值更为加速其等位基因丧失那么增值更为加速一部分人直接由息肉转变成癌一部分人直接由息肉转变成癌C

13、-mycC-myc的过量表达的过量表达K-rasK-ras的突变的突变癌基因激活癌基因激活抗癌基因丧失抗癌基因丧失遗传型遗传型FAPFAP突变突变FAPFAP丧失丧失DCCDCC基因丧失基因丧失P53P53基因丧失基因丧失转移转移大肠癌大肠癌腺癌或息肉腺癌或息肉正常肠上皮细胞正常肠上皮细胞人大肠癌癌变的分子机理人大肠癌癌变的分子机理检测检测rasras方法方法PCR-ASOPCR-ASOPCR-SSCPPCR-SSCPDNADNA测序列测序列检测检测P53P53方法方法PCRPCR小小 结结检验医学的开展方向检验医学的开展方向1分子诊断的内容从传统的分子诊断的内容从传统的DNA诊断开诊断开展到

14、核酸及其表达产物展到核酸及其表达产物mRNA、蛋白质、蛋白质的全面诊断；的全面诊断；2分子诊断的战略从利用分子杂交、分子诊断的战略从利用分子杂交、PCR等单一技术的诊断开展到有机组合多项技等单一技术的诊断开展到有机组合多项技术的结合诊断；术的结合诊断；3分子诊断的方法从定性诊断开展到半定分子诊断的方法从定性诊断开展到半定量和定量诊断，核酸标志技术，特别是荧量和定量诊断，核酸标志技术，特别是荧光标志技术的开展，荧光定量光标志技术的开展，荧光定量PCR技术等技术等方法日益成熟；方法日益成熟；检验医学的开展方向检验医学的开展方向4分子诊断的范围从单基因疾病孟德尔分子诊断的范围从单基因疾病孟德尔遗传性疾病，诸如白血病、早老症、血红蛋遗传性疾病，诸如白血病、早老症、血红蛋白病、甲型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，白病、甲型肝炎病毒，人类免疫缺陷病毒，人乳头瘤病毒等的诊断开展到多基因病人乳头瘤病毒等的诊断开展到多基因病肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、本身免疫性疾病等的诊断。病、本身免疫性疾病等的诊断。5分子诊断的运用多治疗性诊断开展