细胞因子的检测与应用ppt课件

1、细胞因子的检测与运用苏州市跃亚生物技术赵寅岗暨BD CBA技术简介流式的根本原理流式检测细胞因子CBA技术的运用 流式细胞术Flow Cytometry, 简称FCM是一种可以快速、准确、客观，并且可以同时检测直线流动形状中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。 流式细胞仪Flow Cytometer集激光技术、电子物理技术、光电丈量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术定义BD Accuri C6流式细胞术原理Multicolor Research Applicationsbdbiosciences/spectra样本搜集

2、及处置流式细胞术流程免疫荧光染色上机检测数据分析制备单细胞悬液流式细胞术检测样本 可检测的样本种类多样 各种细胞如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培育的细胞，微生物，人工合成微球等流式细胞仪的检测范围 细胞构造细胞大小细胞颗粒度细胞外表积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量 细胞功能细胞外表/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位 流式的根本原理流式检测细胞因子CBA技术的运用一个细胞的全面研讨Cell Vol. 132, January 25, 2021什么是CBA?多重分析节约

3、样本灵敏度高 CBA是利用一系列荧光强度不同的微球，同时分析样本中多种可溶性成分的流式检测方法。每个CBA微球有特定的荧光强度，大小一致，包被有特异性抗体，提供了捕获外表，有效捕获待测蛋白，再参与荧光标志PE的检测抗体，构成“三明治夹心复合物进展检测。+Analyze of InterestFluorescent Detector Ab- PECapture BeadCapture Ab一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本孵育后，构成“三明治复合物。CBA原理CBA原理+100100101101102102103103104104Bead IntensityFL3 (670

4、LP)Detector Ab IntensityFL2 (585/42BP)BDTM CBA Kits操作步骤 检测物与捕获微球共孵育 标志荧光探测试剂FITC或PE标志 洗涤 流式细胞仪检测 CBA分析软件批量数据分析Human Th1/Th2 Cytokine CBA 规范曲线规范曲线5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml 625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisti

5、cy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.26 B = 5.00 C = 3.60 D = 3.89 R2 = 0.9973Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.29 B = 4.24 C = 3.43 D = 4.33 R2 = 0.9991Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.34 B = 4.11 C = 3.42 D = 4.45 R2

6、= 0.9987Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.31 B = 3.86 C = 3.30 D = 4.45 R2 = 0.9980Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x/C)B) + DA = 1.31 B = 3.77 C = 3.37 D = 4.77 R2 = 0.9997Curve-Fitting Model: 4-Parameter Logisticy = (A - D)/(1 + (x

7、/C)B) + DA = 1.33 B = 4.08 C = 3.24 D = 4.42 R2 = 0.9987T TN NF F- -a a110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II IF FN N- -g g1101001000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI

8、II IL L- -1 10 0110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II Il l- -4 4110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II IL L- -5 5110100100010000110100100010000C Co on nc

9、 ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI II Il l- -2 2110100100010000110100100010000C Co on nc ce en nt tr ra at ti io on n ( (p pg g/ /m ml l) )F FL L2 2 M MF FI ICBA 分析软件Home ScreenToolbarCalibration entry screen 根本原理与CBA kit类似 检测原理不同： Flex Set微球带有近红外和红色两种荧光，分别在流式细胞仪的FL

10、3近红外荧光和FL4红色荧光通道检测，经过这个二维矩阵对应于微球上的特定序号识别捕获微球，从而定性目的蛋白，PE标志的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量。BD CBA Flex SetBD CBA Flex SetABCDEFGHI1 2 3 4 5 6 7 8 9FL4-H or Red-AFL3-H or NIR-AABCDEFGHI1 2 3 4 5 6 7 8 9FL4-H or Red-AFL3-H or NIR-A CBA Flex Set的分析软件 FCAP Array SoftwareCBA Kit与CBA Flex SetCBA Kit同时检测5或者6个全部试剂CBA An

11、alysis Software检测目的组合固定CBA Flex Set同时检测30个需另购Buffer kitFCAP Array Software检测目的可自在组合CBA特点 液相中反响，同时检测多种蛋白 操作简单(标本制备和上机检测，省时省力 微量样本(5-50ul) 灵敏度2.8pg/ml 一切分析只需一组规范曲线 防止酶联反响信号放大带来的假阳性 更好的线性度和更宽的检测范围(5000pg/ml) 流式细胞仪和CBA软件自动分析传统的ELISA与CBA相比ELISACBA样本量体积大多元和同步单一Elisa样本体积的1/6灵敏度低，稳定性差灵敏度高，稳定性好芯片式集成测定，所需样本浓度

12、低缩短时间，提高效率每个蛋白分别检测，样本浓度高，时间长，效率低酶联放大效应，结果易失真流式荧光定量检测，防止假阳性现有CBA Kit产品Human Anaphylatoxin KitC4a, C3a, C5aHuman Chemokine KitIL-8, RANTES, MIG, MCP-1, IP-10Human Inflammation KitIL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70Human Th1/Th2/Th17 KitIL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g,IL-17AHuman Th1/Th2 Cytoki

13、ne KitIL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF, IFN-gHuman Th1/Th2 Cytokine II Kit IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-gMouse Inflammation KitIL-6, IL-10, MCP-1, IFN-g, TNF, IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNFMouse Immunoglobulin Isotyping KitHeavy and light chain isotypes ofIgG1, IgG2a

14、, IgG2b, IgG3, IgA, IgM, IgEMouse Th1/Th2/Th17 KitIL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF, IFN-g,IL-17ANon-human Primate Th1/Th2 Cytokine KitIL-2, IL-4, IL-5, IL-6,TNF, IFN-gHuman Inflammation Lyophilized StandardsIL-8, IL-1b, IL-6, IL-10, TNF, IL-12p70Human Th1/Th2 Cytokine Lyophilized StandardsIL-2, IL-4, IL

15、-5, IL-6, IL-10, TNF, IFN-gMouse Inflammation Lyophilized StandardsIL-6, IL-10, MCP-1, TNF, IFN-g, IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine Lyophilized StandardsIL-2, IL-4, IL-5, IFN-g, TNF现有CBA Flex Set产品 人小鼠大鼠IFN-,INF-IL-1 ,IL-1, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-12p70,

16、 IL-13, IL-17A, IL-21, IL-23p40TNF,TNFR,TNFRIP-10I-TACMIGMCP-1MIP-1 , MIP-1 EotaxinRANTESCD54(ICAM-1)CD62E,CD62P,CD62LCD106(VCAM-1)sCD40sCD154(CD40 Ligand)sCD121a,sCD121bSoluble CD14Basic FGFVEGFAngiogeninG-CSF,GM-CSFLIFLT-OSMGranzyme A, Granzyme BFas Ligand ( FasL )FractalkineIgA, IgG1, IgG2, IgG3,

17、 IgG4, IgM, Total IgG,IFN- IL-1 ,IL-1, IL-2,IL-3, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-21, IL-23p40,TNFMIGMCP-1MIP-1 , MIP-1 RANTESKCCD62E(E-Selectin), CD62L(L-Selectin)G-CSF,GM-CSFIFN- IL-1 , IL-4 , IL-6, IL-10TNF 流式的根本原理流式检测细胞因子CBA技术的运用CBA 运用 检测对象 血清、血浆、眼泪、房水、唾液、体腔灌洗液

18、、细胞培育液上清、细胞裂解物等 运用领域 肿瘤研讨及肿瘤疾病的辅助诊断、疗效和预后监测 干细胞研讨和干细胞治疗监测 免疫学研讨和免疫疾病的辅助诊断和监控 感染疾病的研讨及辅助诊断和疗效评价 免疫功能监测 药效评价，药物研发、疫苗研讨 细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白定量分析一、CBA的免疫学运用-Th1/Th2IFN、IL-2IL-4、5、6、10IL-4、10IFN细胞免疫体液免疫Th1介导细胞免疫、细胞毒性T细胞(CTL)生长和活化、巨噬细胞(M)活化迟发型过敏反响。Th2B细胞生长、活化和分化。Th1/2的平衡关系着免疫平衡现有CBA Flex Set产品-信号蛋白Phospho

19、Akt1(S473)Phospho Akt2(S474)Phospho BLNK (Y84)Phospho p120 Catenin(Y228)Phospho Btk (Y551)Phospho MEK1/2(S222)Phospho eNOS (S1177)Phospho Paxillin(Y118)Phospho ERK1/2 (T202/Y204)Phospho Pyk2(Y402)Phospho Itk (Y511)Phospho SLP-76(Y145)Phospho JNK1/2 (T183/Y185)Phospho c-jun(S63)Phospho p38 (T180/Y182)Phospho stat3Ph