经典多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定

1、经典多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定多药耐药基因-腺病毒重组表达载体的构建及鉴定【摘要】目的 构建多药耐药(multidrug resistance, mdr) 基因-腺病毒重组表达载体。方法 将mdr1基因插入到腺病毒载体， 用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞，制备重组病毒悬液并 感染靶细胞进行鉴定。结果构建的mdr1-腺病毒载体在293细胞中 大量产生，病毒滴度达109 pfu/ml,此病毒感染靶细胞后，在靶细 胞中有mdr1基因的表达。结论 成功构建了 mdr1-腺病毒重组表达载 体。【关键词】多药耐药基因；腺病毒载体；转染construction and ident

2、ification of multi-drug resistance gene- adenovirus recombinant expression vector liu yuxia, chen jun,yu hong. j订in provincial institute of cancer research, changchun 130012, chinaabstract objective construction of multi-drug resistanee gene (mdr) - adenoviral recombinant expression vector methods m

3、dr1 gene will be inserted into the adenovirus vector, by calcium phosphate precipitation method the recombinant plasmidtransfect into 293 cells recombinant virus suspension is made and infeced target cells and to indentify. results constructed mdr1- adenovirus vector produces a large number in 293 c

4、ells, the virus titer is up to 109 pfu/m1. after the recombinant virus infectedtarget cells in the target cells have the expression of mdr1 gene. conclusion mdr1- recombinant adenorirus vector has been successfully constructcdkey words multi-drug resista nee ge ne (mdr1) ； adenovirusvector； transfec

5、tion多药耐药性(multidrug resistance, mdr )是指肿瘤细胞能 对多种结构、功能及杀伤机制均不同的化疗药物产生耐受。肿瘤组织 多药耐纱性的产生主要是由于肿瘤细胞内多约耐约基因(mdr1 )异 常扩增和过渡表达所致，表达产物为分子量170 kd的糖蛋白(p-glycoprotein , p-gp )。该蛋白作为一种依赖atp能量的大 分了药物或毒物的溢出泵，可把进入细胞内的药物或异物排出细胞外, 使肿瘤细胞产生耐药。利用mdr1的这一特性，本研究使用腺病毒作 为载体，构建mdr1基因-腺病毒重组表达载体，并转导入脐血有核 细胞，对此重组载体转染靶细胞的有效性进行鉴定。1

6、材料与方法1. 1材料phamdr质粒,美国国立健康研究院greegard. odegaarden博士惠赠；腺病毒载体试剂盒,dna修平试剂盒，粘 粒载体，takara 公司；rpmi1640, gibco 公司;fcs, tbd 公司;dna 纯化/回收试剂盒，北京鼎国;mdr1包装试剂盒,novagen公司°iiek293 细胞，感受态大肠杆菌dh5 a ,由吉林省肿瘤防治研究所保存。1. 2 mdr1的体外扩增将phamdr质粒转化到感受态大肠杆菌 dh5a^el,并将此感受态细菌接种到含氨节(50 u g/ml) 的lb培养基中筛选

7、阳性克隆进行扩增，用碱裂解法提取phamdr质 粒 dna²o1. 3扩增的phamdr质粒的鉴定及回收1.3.1 phamdr质粒的鉴定 将提取的质粒dna沉淀溶解后用xhol i和sac ii进行双酶切，然后将质粒dna及过夜双酶切的质粒dna 同时用0. 8%的琼脂糖进行电泳，鉴定mdr1基因扩增效果，结果见 图 1、2o1. 3. 2 mdr的回收 将电泳所见45 kb附近的泳带切回，按dna 回收试剂盒说明进行回收，将回收的dna贮存于-20冰箱。1. 4 mdr1-腺病毒重组表达载体的构建 将回收的mdr1基因用dna修平试剂盒修平后(

8、dna-tpc),与粘粒载体(cosmid dna)进行连 接，用磷酸钙共沉淀法将cosmid dna和dna-tpc转染到293细胞, 2周左右在一些培养孔内可以观察到细胞的病变和死亡，转移这些已 经完全死亡培养孔的培养液(含死细胞)到一个消毒的1. 5 ml的离 心管中，反复冻融6次后，5 000 r/min离心5 min,收集上清，即 为重组病毒悬液。储存在-80°c,备用。1. 5 mdr1-腺病毒重组表达载体的鉴定 采用mdr1-腺病毒重组 表达载体感染靶细胞(脐血有核细胞)的方法。1. 5. 1脐血有核细胞的获取用氯化胺裂解法³

9、; 分离脐血有核细胞，调细胞浓度为5xlo07/ml,加入到24孔细胞 培养板，每孔100 u lo1. 5. 2病毒感染靶细胞 取在-80°c保存的样品原液以及用含 10%fcs dmem稀释成3、10、20、40倍的样品到24孔培养板，每孔 100 u1,各做4个复孔。在感染的前20 min内，摇动培养板3次, 每次摇动后均放入37°c, 5%c0₂培养箱，1 h后完成感染， 补加培养液，24 h后检测靶基因的表达。1. 5. 3靶基因的检测 提取以上转染mdr1-腺病毒载体的脐血 有核细的dna,采用pcr扩增法进行mdr

10、1全长及特杲片段的检测。 mdr1全长及特异片段(157 bp)引物均由上海生工合成。mdr1全长 序列为:上游引物atggatcttgaaggggaccgcaatggagg下游引物 catctcatacagtcagagttcactggcgco 反应体系为 25 卩1。反应条件： 94°c 60 s, 55°c 80 s, 72°c 150 s,共 30 个循环，72°c延伸 10 min； mdr1特异片段(167 bp)序列为：上游引物ccc atc att gca ata gca gg下游引物gtt caa act tct gct cct gao反

11、应体系为25 n 1,反 应条件：94°c 30 s, 55°c 60 s, 72°c 70 s,共30个循环，每个循 环增加1 s, 72°c延伸10 mine mdr1全长及特异片段pcr产物分别用 0. 8%和1. 5%的琼脂糖进行凝胶电泳，结果见图3、4o2结果2. 1 mdr1体外扩增结果 见图1、2o pha mdr质粒全长为15 192 bp （见图1）。经xhol和sacii双酶切后，出现2条泳带，一条为pha 质粒，大约为11 kb；另一条为mdr1,大约为4. 7 kbo从屯泳结果 可以看出，此2条屯泳条带位置正好与此符合（见图2）。

12、1. dna marker 2. 3. 4phamdr 质粒 图 1 piiamdr 质粒 1. dna marker 2.双酶切 pha mdr 图2双酶切piiamdr质粒2. 2 mdr1-腺病毒重组载体转染脐血有核细胞的鉴定转染mdr1 的脐血有核细胞进行dna提取后，用mdr1全长及特异引物进行pcr 扩增，并分别用08%和15%的琼脂糖进行凝胶电泳，结果见图3、 4o mdr1全长大约45 kb,从图3可以看出，此位置上可见一泳带； 设计的mdr1特异片段为157 bp,从图4可见在此附近有一条泳带, 证明mdr1基因已转染入脐血有核细胞。3讨论肿瘤细胞耐药类型分为：原发性耐药、继

13、发性耐纱和多药耐-药。 人类mdr基因家族包括mdr1和mdr2o其中mdr1为有功能的耐药 基因，其cdna全长4 669 bp,共编码1 280个氨基酸残基 ^ll,而 mdr2 为无功能耐药基因。1970 年，biedler riehm等²首先描述了 mdr表型，即一种药物诱导产 &的耐药细胞株可以对其他多种化学结构和功能完全不同的化疗药 物产&耐药。利用mdr的特点，木实验采用腺病毒作为载体，将mdr1 基因转导入造血细胞，探讨一种有效的基因转导方法，同吋可以发挥 其对化疗药物的抵

14、抗作用。基因治疗的成功，在于选择合适的载体和靶细胞。作为常用的基 因治疗的病毒性载体，腺病毒载体具有很多优点⁴：首 先，其安全性好，经临床和实验证实，无致病和致癌作用，不会引起 癌基因激活；宿主范围广，可以感染分裂期和非分裂期细胞；病毒滴 度高；装载容量大，且无免疫原性，可反复使用。由于其病毒产量高， 可以感染静止期和分裂期的细胞的特点，使z应用起来比较方便，在 实际操作中，不必使用造血因了來诱导细胞进入分裂状态即可进行转 染，节省了使用造血因子的费用，而且从我们的实验结果可以看出， 转染后的耐药效果比较好。恶性肿瘤化疗过程中对正常细胞及骨髓细胞的

15、损伤常使得化疗 方案不能如期实施，从而影响肿瘤化疗的效果。克服这些问题的策略 z就是向造血细胞中导入外源mdr1基因拷贝并使z过度表达，从 而使大剂量化疗的反复进行成为可能。本研究基于这一出发点，以经 过改造的复制缺陷型腺病毒作为载体，构建了 mdr1-腺病毒重组表达 载体，并用其感染靶细胞，取得了较好的感染效果。从感染的脐血有 核细胞中提取的dna经pcr扩增后的电泳结果可以看出，腺病毒载体 已将mdr1转染入脐血有核细胞中。木实验的结果可以初步证明，使 用腺病毒载体可以将多药耐药基因有效地转染到靶细胞(脐血有核细 胞)中，此方法将來如果运用于临床，将会增强患者造血干细胞对化 疗药物的抵抗性以及对提高化疗疗效发挥很好的作用。参考文献1金冬雁，黎孟枫，等.分子克隆实验指南.科学出版社，2002： 908.2金冬雁，黎孟枫，等.分子克隆实验指南，1992： 19.3刘玉侠，夏凤琴，石虹，等.licl对脐血有核细胞增殖、凋 亡及细胞周期的影响.实用肿瘤学杂志，1998, 12 (1)： 15.4 maione d, della rocca c,gian