类天疱疮的临床特征与其靶抗原关系的研究-

1、类天疱疮的临床特征与其靶抗原关系的研究*作者：金岩1,黄懿1,成扬2,付海军3【摘要】对56例江浙沪地区类天疱疮患者的临床特征和不同靶抗原的关系 进行了探讨，发现类天疱疮多发于老年人，并以大疱性多见；在bp的急性期抗 体结合230kd、230/180kd.合并条带靶抗原较常出现(86.11%);而在疾病的缓 解期抗体结合180kd抗原较常出现(65%) ; 180kd靶抗原并非次要抗原。【关键词】类天疱疮；临床特征；靶抗原abstract 56 cases of bullous pemphigoid(bp) were studied on the clinical characters and

2、 immunolblot patternst was found that bullous pemphigoid happened mostly among old people in bullous type ; autoantigen bp230 , bp230/180 and bp 230/180 combined with minor antigens involved in acute phase of bp patient ;while bp180 involved mainly in the remission of thedisease.autoantigen bp180 we

3、re not minor antigen.key words bullous pemphigoid ; clinical characters ; autoantigen大疱性类天疱疮（bp）是一种发生于老年人的自身免疫性大疱病，临床表现为全身泛发性、张力性大疱，尼氏征阴性，病程反复迁延，严重威胁患者的生命 健康。bp血清中有多种抗皮肤基底膜不同成分的抗体，有靶抗原分子量为230kd、xxxx年12月xxxx年12月华山 医院 皮肤科和东方医院门诊、病 房就诊的江、浙、沪地区汉族类天疱疮患者，根据临床表现、组织病理和直接免 疫荧光检查，符合诊断标准确诊。1.1.2方法我科专病门诊、病房大疱病患

4、者，常规做病理活检，手术时 将切下的组织块分为两份，一份做常规组织病理检查，另一份做直接免疫荧光检 查；确诊的bp患者抽取外周新鲜血5ml，留血清209冻存用于测定bp抗原分 子量；除对患者的一般情况如年龄、性别、发病时间等进行记录外，并根据以下 内容对bp病例进行登记、随访。（1）临床类型：根据临术表现将bp分为大疱 性、小疱性、局限性和痒疹性等。（2）黏膜损害情况：有黏膜损害；无黏膜 损害。（3）痒感：有明显痒感；无明显痒感。（4）病情：重度：指不断出现 张力性水疱和显著红斑，累及体表面积50%以上；中度：指皮损面积在20% 50%之间；轻度：皮疹散在分布或局限在身体某一部位，皮疹面积在2

5、0%以 下。（5）病期：活动期：指患者不断岀现张力性水疱和显著红斑；稳定期： 无明显水疱发生，只有陈旧皮损。1.2皮肤表皮抗原的提取1.2.1材料1.2.1.1组织 取新鲜外科截肢手术皮肤6cmx6cm数块。1.2.1.2主要试剂及仪器 三轻甲基氨基甲烷仃ris , farc0产品）；苯甲基磺酰氟（pmsf , promega产品）;依地酸钠（edta , sigma产品）;蛋白酶抑制剂(pepstatin , antipain , leupeptin , chymostotin , sigma 公司产品);十二烷 基硫酸钠（sds ,日本进口分装）；高速低温离心机（hitachi ,日本进口

6、）； 751型分光光度计（上海第三分析仪器厂）；热分离缓冲液；12.5mmol tris-hci , ph6.8 , 100pl pmsf（热分离前加）;表皮提取液:2%sds , 65mmol tris-hci , ph6.8 , 20mmol pmsf , 10mmol edta ,含四种蛋白酶抑制剂（热分离前加）。1.2.2方法（1）新鲜外科手术皮肤标本，用图钉固定在木板上，用手术刀除皮下脂肪组织，削真皮至0.5mm厚，冷生理盐水反复冲洗。（2）热分离缓冲液 分两份，一份置379水浴，另一份置569水浴，10min备用。（3）将皮肤剪成2cmx2cm大小，放入37°c热分离缓冲

7、液20min ,再迅速放入56。（3热分离缓冲液中40s，取出冷却，用手术刀背轻轻分离表真皮。（4）表皮按25 30cm2比1ml的比例加入表皮提取液中，放入组织匀浆器内匀浆（匀浆器放冰中）。（5）匀浆液置 塑料管中，于液氮中反复冻融3次，每次10min后12000rpm离心,4°c ,30min , 取上清即为表皮提取液，40°c保存。（6）751分光光度计测定表皮抗原提取液蛋 白含量，在595nm处测0d值，参照标准蛋白（小牛血清白蛋白），计算 样品 中蛋白含量。1.3 sds聚丙烯酰胺凝胶电泳1.3.1材料（1）表皮抗原提取液；（2）主要试剂及仪器丙烯酰胺(acryl

8、amide ,fluka 产品)；甲叉丙烯酰胺(n '-methylenebis-acrylamide ,fluka产品）;四甲基已二胺（temed , promega产品）;过硫酸胺（aps ,华美公司产品）；次高分子量标准分子蛋白（上海生化所产品）；甘氨酸（gly ,上海试剂三厂，分析纯）；三轻甲基氨基甲烷仃ris , farco产品）；2疏基乙醇（2-me , fluka产品）；垂直电泳槽（上海精益有机玻璃制品厂）；稳流稳压电泳仪（丹阳无线电一 厂）;聚丙烯酰胺母液（acr-bis ,丙烯酰胺30g ,甲叉丙烯酰胺0.8g ,双蒸水加至100ml ,磁力搅拌溶解，过滤，置棕色瓶4

9、°c保存）；浓缩胶（acrbis 0.6ml , 0.5m ph6.8 1.25ml ,双蒸水 3.1ml , 10%sds 0.05ml , 10%aps 0.025ml , temed 5 pl);分离胶(acr-bis 2.3ml , 1.5m ph8.8 tris-hci 2.5ml ,双蒸水 5ml , 10%sds0.1ml , 10%aps 0.1ml , temed 10pl);电泳缓冲浓缩液(tris 15g , gly 7.2g ,sds 5g，双蒸水加至500ml，过滤，使用时1:10稀释)；样品液(12mm tris-hci ph6.8 ,含20%甘油，10%

10、sds , 10%2-me ,漠酚蓝适量）。表皮提取液与样品液混合，用时煮沸；固定液（500ml无水乙醇，100ml冰醋酸，400ml双蒸 水）;脱色液（250ml无水乙醇，80ml冰醋酸，加双蒸水至1000ml）;染色液（考 马斯亮兰0.29g ,加250ml脱色液，棕色瓶49保存）。1.3.2方法1.3.2.1 sds聚丙烯酰胺凝胶电泳 将干净的长短玻璃板用橡皮圈套好放入垂直电泳槽，螺母固定，底边缝隙用1%琼脂封闭，配制分离胶，轻倒入两玻璃板间空隙内，再加入少量含正丁醇双蒸水，将分离胶压平，静置，过夜，倒 去水，配制浓缩胶，轻倒入分离胶上方空隙内，插入塑料梳，静置3ho轻取塑 料梳，分别加

11、入标准品和样品，两侧水槽内加入电泳缓冲液,100v ,1h，再160v 34h。1.3.2.2显色将电泳好的凝胶小心取岀，放入固定液中，置摇床上摇动 1h ;再将凝胶放入染色液中，56°c ,摇动10min ;再放入脱色液中，摇动过夜。 最后观察凝胶上抗原蛋白的分离效果确定是否转印。1.3.2.3蛋白质抗原分子量的测定 在一定的分子量范围内，蛋白质的泳 动率和分子量的对数呈直线关系。logmw = k1-bx b :斜率；x :泳动率在实际测定时，可先测量标准蛋白质自分离胶起点至区带中线距离做横轴 坐标，然后将标准蛋白质分子量换算成对数值作纵坐标，作岀标准曲线。测量蛋 白抗原的电泳距

12、离，在曲线上查出相应的分子量的对数值，即可计算出待测蛋白 质的分子量。1.4 western-blot1.4.1材料1.4.1.1材料 经上述sds聚丙烯酰胺凝胶电泳好的凝胶。1.4.1.2试剂和仪器 甘氨酸（gly，上海试剂三厂）；小牛血清白蛋白（bsa ,中科院生化所产品）；辣根过氧化物酶标记羊抗人igg抗体（sigma产品）；半干 式转印电泳槽（上海医科大学仪器中心产品）；硝酸纤维膜（nc ,浙江黄岩生化材料厂）;印度墨水染色（12.5mm tris-hci , ph 6.8 , 4%印度墨水）;转移电泳缓冲液（tris 3g , gly 14.4g , sds 1g , ddh2o 6

13、00ml ,临用前加入甲醇 150ml）o1.4.2方法1.4.2.1蛋白转移电泳 将电泳好的凝胶去除浓缩胶和琼脂糖，置于转移 电泳液中20min，裁取与凝胶相同大小的nc膜和6张滤纸，另置于转移电泳液 中15min ,将3张湿滤纸、nc膜、凝胶、3张湿滤纸依次叠压在一起，放入半 干式转印电泳槽中，再加入适量转移电泳液，50v ,电泳左右，将nc膜取出，用印度墨水染液染色，观察转移效果和标准蛋白位置。1.4.2.2相酶免疫检测抗原印迹nc膜放入pbs(含5% bsa、0.5%tween-20)溶液中，室温下平缓摇动5h ;再切成3mm宽的条带，置于反应槽中， 加入按1:10稀释的待测血清及健康

14、对照血清各1 ml ,室温下平缓摇动2h，倾去反应液，用免疫印迹洗涤液洗涤三次，加入1:400稀释辣过氧化物酶标记羊抗 人igg(hrp-lgg)溶液1ml ;室温下平缓摇动1h ,倾去反应液，用免疫印迹洗涤 液洗涤三次，加入显色底物液，至出现明显的区带，双蒸水洗涤，2m h2so4终止反应。2结果2.1临床资料总结根据临床表现、组织病理及直接免疫荧光检查共确 诊56例bp患者，其中男32例，女24例，男:女二1:33 ;年龄范围3694岁， 平均年龄(66.64±14.09)岁，病程从0.5 个月，平均病程(5.55±19.54)个月。 其年龄分组情况见表1和图1o表1

15、56例bp患者的年龄构成图1研究对象的年龄构成56患者中，黏膜损害的有17例，占30.36%0有痒感的25例，占44.64% , 严重程度病情比较重的有32例，占57.14% ;病情较轻的有24例，占42.86% ; 类型中大疱性的有48例，占85.71% ;非大疱性的有8例，占14.29%o急性期 的有39例，占69.64% ;缓解期的有20例占35.71%。从表1可看出，bp患者的发病年龄50岁以下的有12例，占21.43% , 60岁以上的有40例，占71.4%o结果显示bp多发于老年人。2.2 56例bp患者的免疫印迹结果 免疫印迹部分结果见图2（见附页1）o 从图2看出，bp患者血清

16、可结合230kd、180kd. 230/180kd或230、180合并100kd等条带。56例bp患者中，免疫印迹阳性的有50例(89.28%),阴性的有6例 (10.71%);阳性者中,单独抗原分子量180kd阳性的有16例(28.57%),单独 230kd阳性的有4例(7.14%) , 230kd、180kd同时阳性的有11例(19.64%), 230kd和(或)180kd合并其他xxxx年人的自身免疫性大疱病，临床表现为红 斑基础或正常皮肤上的紧张性大疱，尼氏征阴性，病情重者皮损累及全身，并可 有黏膜损害，痒感轻重不等；病情轻的皮损可散在分布，也可表现为局限性分布。 类天疱疮可分为大疱性

17、类天疱疮、局限性类天疱疮、疤痕性类天疱疮、多形性类 天疱疮等，其病情反复迁延，可急性发作或临床缓解。大多数类天疱疮对激素敏 感，用激素治疗疗效较好；少数对激素不敏感，须用免疫抑制剂、美满霉素或 雷公藤制剂等。56例类天疱疮的临床研究资料表明，类天疱疮多发于60岁以上的老年 人，就发病年龄不同于其他结缔组织病，其原因尚待进一步探讨。类天疱疮的黏 膜损害较天疱疮少见，本研究中黏膜损害约占30%左右，而我科有关天疱疮的 资料表明天疱疮的黏膜损害约占70% - 80%左右；类天疱疮以大疱性类天疱疮最常见，其次为局限性、小疱性、痒疹性。bp患者如不进行治疗。其病情可延续数月至数年。国外曾经有一项预测 b

18、p进程的研究，作者对该病的多项临床及实验室特征进行了分析，未能发现 任何可预测疾病进程的指标1 最近有两项对bp自身靶抗原与疾病预后相关 性的研究，证实存在抗bpag2循环抗体的患者病情较重，需要更大剂量的皮质 类固醇激素控制病情，预后差2,3b说明bpag2自身抗体在该病发病过程 中起更重要的作用。免疫印迹技术常用于检测类天疱疮抗体 充分地提取表皮基底膜中的蛋白 抗原成分，是运用免疫印迹技术测定该类抗体的重要组成部分。目前常用的分 离表、真皮的 方法 有三种，即o.1mol/l edta分离法、56°c热分离法和1mol/l naci分离法，我们实验室采用569热分离法分离表、真皮

19、，结果表明本法对抗 原活性 影响 较小且敏感性好，提取液中蛋白含量可达50mg/mlo类天疱疮是一种自身免疫性大疱病，其患者血清中有多种抗皮肤基底膜不 同成分的抗体，有靶抗原分子量为230kd、xxxx年来国内的研究结果发现 180kd抗体的检出率高于230kd , 180kd抗原并不是bp的次要抗原。我们的 免疫印迹结果显示230kd抗体阳性为36例，占64.29% ;180kd抗体阳性为41 例，占73.21% , 180kd抗体阳性率高于230kd抗体，且180kd抗体在疾病的 急性期有阳性，在缓解期也持续阳性，提示这两种抗体在疾病的不同时期其作用 是有差异的。目前已知编码bp抗原230

20、kd的基因位于6号染色体短臂的6p11-12位 点，编码180kd的基因位于10号染色体长臂的10q24.3位点上，两组基因表 达的蛋白氨基酸顺序和结构不同,230kd含2606个氨基酸，其空间结构可能是 双螺旋；180kd蛋白由1572个氨基酸组成，其结构有许多胶原域。超微结构定 位表明bgag1是一个细胞内蛋白，是构成半桥粒致密斑块的主要成分;bpag2 是一个跨膜蛋白，其氨基端约55kd位于半桥粒致密斑块上，竣基端约100kd在细胞外，中间是较短的跨膜域；这些bp抗原的编码基因、氨基酸顺序及结构、 超微结构的差异决定了 bpagk bpag2这两类靶抗原在疾病中的作用是不同的。近来研究的研究结果显示，bpag1和bpag2在bp的发病过程中，其 抗原性发生某种变化，导致器官特异的自身免疫，由于bpag2的抗原决定簇在 细胞外胶原域，首先激发免疫反应，自身抗体与bpag2结合后激活补体，造成 细胞膜破裂，此时细胞内的bpag1的抗原决定簇也暴露，刺激免疫系统产生新 的抗体，因此有人认为bpag2在bp的发病过程中起更重要的作用，很可能是 bp自身免疫发病中的始动因子；故在临床上当患者bpag1抗体增高时，疾病 常处于进展期。【参考文献】1 collagen xvii/bp180 : a co