改进液氮冻融法和试剂盒法提取粪便基因组DNA对比研究

1、    改进液氮冻融法和试剂盒法提取粪便基因组dna对比研究    王宁+王占黎+包艳?+刘琦琦摘 要： 目的 比较两种方法提取粪便细菌基因组dna的效果。方法 收集30例健康人的粪便，采用改进的液氮冻融法及试剂盒法提取dna，对总产量和纯度进行分析。pcr扩增细菌16s rdna基因序列，比较不同方法提取人粪便基因组dna效率的差异。结果 采用改进的液氮冻融法提取和试剂盒法提取的dna浓度分别为784±69.13 ng/l、209.98±39.30 ng/l（f=505.085，p关键词： 粪便；细菌基因组dna；聚合酶链式反应g7

2、10一 材料与方法1 样品的采集与储存以灭菌过的粪便取样盒采集30份体检正常的20-30岁志愿者的新鲜粪便样本，并在采集后30 min内送至实验室，于-20 冻存，备用。2 粪便细菌基因组dna提取方法改进的液氮冻融法：粪便前处理2：称取200 mg粪便，加入30 ml pbs涡旋震荡，使样本均匀浑浊。200×g离心5 min，收集上清弃去沉淀。重复洗涤3次。9000×g离心5 min，重复洗涤3次。倒弃上清，留沉淀。加入4 ml pbs缓冲液，取1 ml移入1.5 ml离心管中，-20 冻存。dna提取：8000×g离心5 min，倒弃上清收集沉淀。加入500

3、l te缓冲液，震荡重悬。至液氮中冻结，取出后放入65 水浴融化，反复冻融3次。再加入60 l 10%sds和2 l 100 mg/ml rnase a，55 水浴30 min。加入10 l 蛋白酶k，混匀后于37 摇床摇4 h。加80 l ctab和80 l nacl，混匀65 水浴20 min。加750 l苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），12000×g离心10 min。取上清，加750 l氯仿：异戊醇（24：1），。12000×g离心10 min，取上清，重复上述步骤。在上清液中加500 l预冷异丙醇混合。12000×g离心10 min，弃去上清，在沉淀

4、中加1 ml 75%乙醇冲洗沉淀。在室温中晾干乙醇。用60 l te溶解dna。4 放置过夜后置于-20 冻存。粪便基因组dna提取试剂盒法：按tianamp stool dna kit 说明书进行。3 dna溶液浓度及纯度测定粪便总dna通过紫外微量分光光度计定量检测提取dna浓度，用od260/280检测提取dna的纯度。4 提取dna的pcr有效性分析pcr反应条件：95 预变性4 min；95 变性45 sec，65 退火1 min，72 延伸2 min（20个循环）；95 变性1 min，55 退火1 min，72 延伸2 min（10个循环），72 再延伸10 min。将pcr产物

5、采用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，eb染色，150 v/cm，15 min。用凝胶成像照相分析。5 统计学方法应用spss13.0统计软件进行数据处理，计数资料采用t检验比较，p <0.05为差异有统计学意义。二 结果1 不同方法提取粪便细菌基因组dna产物纯度和浓度比较结果结果显示不同方法提取的粪便dna浓度在各组间均有显著性差（p<0.001）。在提取dna的纯度上，od值在1.8-2.0范围内较好。改进液氮冻融法和试剂盒法的产物纯度（od260/280）是2.11±0.10，1.89±0.05。改进液氮冻融法和试剂盒法的产物产物浓度是 784±6

6、9.13ng/l，209.98±39.3ng/l。效性分析结果2 不同方法提取粪便细菌基因组dna产物的pcr有在200bp处可扩增出特异性条带。粪便dna提取试剂盒提取的dna有清晰明亮的条带。改进液氮冻融法提取的dna条带亮度很大，但个别有拖尾现象。3 不同方法提取粪便细菌基因组dna产物所耗时间和费用对比分析结果改进液氮冻融法用时15h，每个成本6元；试剂盒法用时2.5h，每个样品成本19.6元。液氮凍融法提取粪便dna前需要对粪便样品进行前处理清洗，所以操作所耗时间延长，成本较低。而目前试剂盒提取方法工作效率较高， 但成本也相应提高。三 讨论结合本实验中改进的液氮冻融法，利用

7、pbs缓冲液对冻存粪便进行预处理，结果得到了高浓度的dna产物相对试剂盒法，但产物纯度没有得到提升。试剂盒法提取的产物浓度适中，提取产物纯度较好。但由于成本和耗时的差异，使得此种方法的选择要根据各自实验的特点来进行。在探讨粪便dna的pcr有效性上，液氮冻融法的提取稳定性较好，如果加大核糖核酸酶的使用量会减少rna污染及电泳条带拖尾现象，从而避免使用相对价格昂贵的试剂盒，使粪便dna检测更具廉价性。从粪便中提取高质量肠道菌群总基因组dna是研究分析肠道菌群与相关疾病发生机制的基础和前提。粪便样品中含有大量肠道菌，同时也含有各种肠道脱落细胞、腐殖质及多种无机物和有机物等3。液氮冻融法经过改进比以前的方法在浓度和纯度上有进一步提升。由于目前粪便提取基因组dna试剂盒在提取产物纯度和质量上的稳定性，提高了粪便dna提取效率的同时对肠道菌群dna产物的测序工作奠定了研究基础。综上所述，建议实验室根据具体实验要求和特点、经费支持情况、人力物力来合理选择粪便dna提取方法。参 考 文 献1 刘伟伟，严敏，周丽萍，等.肥胖与肠道菌群的相关性j.