博士论文答辩

1、博士论文答辩博士论文答辩草鱼核苷酸结合寡聚化结构域草鱼核苷酸结合寡聚化结构域 (nucleotide-binding oligomerization domain，NOD )基因和基因和-干扰素相关基因干扰素相关基因( IFN-gamma related gene，IFN-rel)的克隆及其表达的克隆及其表达 指导教师：彭克美指导教师：彭克美 教教 授授 聂聂 品品 研究员研究员 答答 辩辩 人：陈文钦人：陈文钦 华中农业大学动物科技华中农业大学动物科技-动物医学学院动物医学学院 2010年5月30日答辩内容答辩内容五、课程学五、课程学习及文章发习及文章发表情况表情况四、创新点四、创新点及下步

2、研究及下步研究计划计划二、草鱼二、草鱼NODNOD基因基因三、草鱼三、草鱼- -干扰素相关干扰素相关基因基因一、研究一、研究 背景背景1.概述概述 以往为人们所熟知的PRRs主要是一些膜结合蛋白如甘露糖受体、To1l样受体、CD14和清道夫受体等，主要识别胞外环境的微生物结构成分。最近的研究发现，胞浆中也存在着识别细菌和病毒成分的PRRs核苷酸结合寡聚化结构域核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)蛋白。蛋白。一、研究背景一、研究背景2.NOD蛋白的组成和结构蛋白的组成和结构 通过对人类基因数据库同源搜索，现已发现20多个成员： NOD1(CARD4)、NOD2(CARD15)、NOD3-NOD5、

3、NALP1-14 、IPAF、CIITA、NAIP等。 NOD 蛋白主要由三个不同的结构域组成：（1）LRR：是富含亮氨酸的重复序列，位于C端（2）NACHT：位于中央，对于NOD蛋白的寡聚体化和活化非常重要。（3）效应结构域：位于N端，可以是1个PYD，1个或2个CARD ，或者是3个BIR。一、研究背景一、研究背景NOD家族的结构示意图家族的结构示意图NALP1NALP2-14NOD1NOD2CARDPYDNACHTNADLRRBIRADFIINDCIITAIPAFNAIPNOD3NOD4XNOD5一、研究背景一、研究背景3.NOD的识别作用的识别作用 已有研究表明，NOD1和NOD2是细

4、胞内细菌肽聚糖的感受器，能识别细菌肽聚糖(PGN) 的降解产物。NOD1 识别的最小结构是革兰氏阴性细菌的产物内消旋二氨基庚二酸(meso-diaminopimelic acid , meso-DAP) ；NOD2 识别细菌的最基本结构是PGN 的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）。MDP 几乎存在于所有细菌的PGN 中，因此，NOD2 既是G+细菌也是G-细菌的感受器。 一、研究背景一、研究背景 4.NOD 蛋白的信号转导蛋白的信号转导 在非活化状态，NOD1、NOD2 的LRR 和NACHT结合保持分子处于折叠状态。当NOD1 和NOD2通过LRR 和配体结合后可以打

5、开，通过NACHT自身寡聚，NOD分子的CARD 和下游RICK分子的CARD 结构域发生嗜同种结合，活化RICK。经过复杂的磷酸化，活化NF- B，诱导促炎细胞因子的转录以及抗菌肽的合成。 一、研究背景一、研究背景NODs介导的信号传导通路图介导的信号传导通路图 5.NOD蛋白的生物学功能蛋白的生物学功能 NOD蛋白主要的生物学功能是加强机体免疫系统探测微生物感染的能力，产生IL-1等促炎因子，调节免疫应答和炎症反应。近来的研究发现NOD蛋白除了识别细菌产物外，还可能诱导细胞凋亡、直接参与细菌感染的控制。现在也有最新报道，证明NOD蛋白也在抗病毒免疫中起着重要作用。一、研究背景一、研究背景6

6、.选题的目的与意义选题的目的与意义 尽管对哺乳动物胞内模式识别受体在参与对细菌的识别、诱导炎症反应的作用等方面进行了深入的研究，但国内外对鱼类NOD基因的研究仅有2篇报道。迄今为止，对鱼类NOD基因的结构，转录和蛋白表达的特征以及是否具有类似于哺乳动物的功能还是不清楚的。本论文拟通过对草鱼NOD1和NOD2基因的克隆以及表达分析，旨在揭示鱼类NOD基因的结构与表达特征。同时该研究为进一步研究NODs基因的功能奠定了基础。 一、研究背景一、研究背景二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析1. gcNODs基因的分子特点基因的分子特点1.1 gcNOD1: cDNA包含3215

7、bp，ORF区域为2813bp，大约编码937个氨基酸, 5-UTR为350bp， 3-UTR为52bp 。 C端的LRR结构域，位置在769-791、825-851；N端有一个CARD，结构域在11-73； NOD1的NACHT结构域在186-359。1.2 gcNOD2: cDNA全长3130bp，编码982个氨基酸； ORF为2949bp，编码982氨基酸，5-UTR为81bp， 3-UTR为103bp， C端LRR有7个串联结构域；N端有两个CARD，结构域在27-81、111-200；中间NACHT结构域在271-441。二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析二

8、、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析草鱼NOD1草鱼NOD2草鱼NODs基因的结构示意图NACHTCARDLeucine Rich Repeat二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析2. gcNODs基因的基因组结构基因的基因组结构97496817152324131 99 96 4718955241751804848484 84 84 8484124grass carp NOD1173561127176584 848484 8484319266147 108 87 89 190 90511grass carp NOD2草鱼NOD1基因组全长9kb,由

9、11个外显子和10个内含子组成草鱼NOD2基因组全长5kb,由10个外显子和9个内含子组成二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析3. gcNODs基因的内含子相位基因的内含子相位12345678910gcNOD10122222222zfNOD10122222222hNOD10122222222gcNOD2012222222zfNOD2012222222hNOD2012222222表1.草鱼、斑马鱼以及人NODs基因内含子相位二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析4. gcNODs基因与其他物种基因与其他物种NODs基因的氨基酸相同基因的氨基酸相同/相

10、相似性比较似性比较Full-length CARDsNACHTLRRszebrafish NOD181.3/86.773.1/75.692.5/95.488.2/94.9human NOD150.2/70.938.4/54.758.0/73.057.9/78.5pig NOD151.1/71.534.9/52.358.6/74.757.9/76.9mouse NOD150.4/70.939.5/52.358.0/76.454.9/74.4Full-length CARDsNACHTLRRszebrafish NOD283.8/92.068.5/77.690.1/95.982.8/91.8hum

11、an NOD245.6/62.629.6/46.557.3/73.154.1/67.8pig NOD246.8/65.227.6/47.456.7/73.752.6/69.3mouse NOD247.0/64.728.5/48.459.6/74.353.0/67.0二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析 human NOD1 pig NOD1 mouse NOD1 chicken NOD1 zebra finch NOD1 frog NOD1 grass carp NOD1 zebrafish NOD1 fugu NOD1 stickleback NOD1 medaka

12、NOD1 fugu NOD2 stickleback NOD2 medaka NOD2 grass crap NOD2 zebrafish NOD2 mouse NOD2 human NOD2 chimpanzee NOD2 pig NOD2 cattle NOD2 mouse CARD12 monkey CARD12 human CARD12 chimpanzee CARD127910010010010010096100100100771001001006110089991001001001000.25. gcNODs基因的分子进化树基因的分子进化树二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基

13、因的克隆与表达分析6. gcNODs基因在不同组织中的组成性表达基因在不同组织中的组成性表达二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析7. gcNODs基因在肽聚糖刺激下的诱导型表达基因在肽聚糖刺激下的诱导型表达*二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析*8. gcNODs基因在基因在脂多糖脂多糖刺激下的诱导型表达刺激下的诱导型表达*二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析*9. gcNODs基因在基因在Poly I:C刺激下的诱导型表达刺激下的诱导型表达*二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析10. gcNODs

14、基因在基因在呼肠孤病毒呼肠孤病毒感染感染下的诱导型表达下的诱导型表达*二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析11. gcNOD1基因重组蛋白的表达与纯化基因重组蛋白的表达与纯化97.466.243.031.020.114.4二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析11. gcNOD1基因重组蛋白的表达与纯化基因重组蛋白的表达与纯化M 1 2 3 4 5 6 7 897.466.243.031.020.1二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析12. gcNOD1蛋白的免疫组化蛋白的免疫组化ABCDEF二、二、gcNODs基因的克隆与

15、表达分析基因的克隆与表达分析13.13.小结小结（1）首次从鱼类中克隆了NOD1和NOD2基因，氨基酸的排列、基因组结构以及内含子相位的分析都显示了NOD1和NOD2在进化上具有很强的保守性；（2）荧光定量分析显示草鱼的NOD1和NOD2基因呈广泛的组成性表达分布，在所检测的组织中都可以检测到表达；二、二、gcNODs基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析（3）来自革兰氏阳性菌的PGN对草鱼NOD1的表达在大多数组织中没有显著的作用；（4）在LPS刺激下，gcNOD1的诱导表达特征与gcNOD2相似；（5）polyI:C和病毒感染也能诱导gcNOD1和gcNOD2的表达。三、三、gc IFN

16、-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析1. gcIFN-rel基因的分子特点基因的分子特点 IFN-rel基因的cDNA包含861bp， 其中5- UTR长39 bp，ORF长504bp编码167个氨基酸，3- UTR长316bp。 3- UTR富含AT（75.2%），一个潜在的多腺苷酸加尾信号（AATAAA)位于polyA尾上游13bp。三、三、gc IFN-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析AAATTCGCTTGGTTCACAGCACCAAAACACAAACACAAAGAATGGATTCTTGGCTCAACA M D S W L NTGATGCTGCTGTGTGGAC

17、TTCTGTTAATAGCATCTCTTCAGACAACCAACGCTTTCAGATM M L L C G L L L I A S L Q T T N A F R TTCGACGGTCCAAAAGCGAGATGACCCATTTGGAGACAAATATCCACTCTCTGCAAGAACF R R S K S E M T H L E T N I H S L Q EATTATgtaagtgatgtctactatcatgaacttcagcagggggtttgaaagcaactcttgtH Y ctgtgttaacaagatgaatcacttcaagtcctactcatatctgtatgttatagtt

18、tggtcttgcggctaatattagcaagaagagacctattgcacaataaatttcacgaaactttgttcttagattaggagttaagattcaccagagatgcacattcattcataacgtttgctgttttttgcccgctttctttagAAAACACGTGGCACAGAATGGGTTTCAAAGTCTGTTTTTGTTCC K T R G T E W V S K S V F V PTCATCTGAACCAGCTGAATgtaagtttttactgtgcaaaatgctaaaatattaaaatgca H L N Q L N actgaatgatat

19、atatgcctctatatatgtatcatgctaataatacttgtttctcttagTCCAAGGCTTCCTGCACTTGTCAGGCGCTGTTGCTTGAAAGAATGCTGAACATCTACGAAGS K A S C T C Q A L L L E R M L N I Y E AACTTTTCCAAGACATGAAGTCTGAGCATAAAGAAGGGAGAAAAGATCTAGACCATCTAAE L F Q D M K S E H K E G R K D L D H L TGGATGAGGTGAAAAAGCTGAGGGGAAATTATAAGGAAGAACATAAAGTATG

20、GAAAGAGCM D E V K K L R G N Y K E E H K V W K ETTCAGGAAATGAACTCAGTCAAGgtaaacattaagagaaagtcctgtcttcattgtgaatL Q E M N S V K gtgtacattttgagttattgaattgctgtttatcatatgatatcaggtcaggtgatataatatatgatatggtactgtatctaatacaaatatttgtcctcactctcacaagGTGAAAAA V KTGGAACAATCCGAGGAGGAGCATTAAATGACTTTCTCATGGTGTTTGATCGGG

21、CCTCTACN G T I R G G A L N D F L M V F D R A S AGAAAAACACAAAAAGGTTCAATGAGAAGATCCAAAAGTCATGTCTTTCATTTAGTAAACT E K H K K V Q *TTGCGCTTTGTTATTGTGTTAGCCTATTTATTTATAAATTATATGGAAATAATTATTTATTTTTAACTTTATAATGTACTCTACTACACCATCCATAACTTATAATCTAACTTATTCTCATCACAAGTGTGTTTGCATCATTTACAGTGTACAGAAACGATGAACGTTGATTTCTA

22、ACTGGATTTGCTTGAAATATTCTGTGAGCTTCACTGGCTAAATGTTTAATTACAATAAATTAATTTTGCATTAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA 草鱼-干扰素相关基因的cDNA与基因组序列三、三、gc IFN-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析2. gcgcIFNIFN- -relrel基基因与其他物种因与其他物种- -干扰素与干扰素与- -干扰干扰素相关基因同源素相关基因同源性比较性比较SpeciesAmino acid identity/similarity (%)Catfish IFN-rel37.8/63.2

23、Zebrafish IFN-rel62.9/77.6Carp IFN-rel50.0/71.9Zebrafish IFN-19.8/44.3Goldfish IFN-21.7/44Cod IFN-20.6/44.3Catfish IFN-21.8/48.3Carp IFN-20.7/41.4Fugu IFN-17.7/40.7Trout IFN-119.4/48.9Trout IFN-221.5/50.6Salmon IFN-21.9/52.8三、三、gc IFN-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析3. gcgcIFNIFN- -relrel基因与其他基因与其他硬骨鱼类硬骨鱼类-

24、-干扰素干扰素与与- -干扰素相关基因干扰素相关基因的系统发育关系的系统发育关系三、三、gc IFN-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析4. gcgcIFNIFN- -relrel基因的组织表达基因的组织表达三、三、gc IFN-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析5. gcgcIFNIFN- -relrel基因在脂多糖和基因在脂多糖和PolyI:C刺激下的刺激下的诱导性表达诱导性表达*LPS*polyI:C三、三、gc IFN-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析6. PGN的刺激对草鱼的刺激对草鱼IFN-rel、NOD1和和NOD2表达的影响表达的影响三、三

25、、gc IFN-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析7. gcIFN-rel基因基因在在呼肠孤病毒呼肠孤病毒感染感染下的诱导下的诱导型表达型表达*三、三、gc IFN-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析8.8.小结小结(1)序列分析显示本研究所克隆的gcIFN-rel基因是一个 与斑马鱼、鲶鱼和鲤鱼中IFN-rel基因同源的基因，而不是那个早已存在的IFN-基因；(2)与哺乳类和鲑鳟的IFN-不同的是，从20条不同来源的草鱼的序列分析显示，gcIFN-rel在它的内含子中缺乏多态性微卫星序列；三、三、gc IFN-rel基因的克隆与表达分析基因的克隆与表达分析(3) gc

26、IFN-rel呈广泛的组成性表达；(4)聚肌胞甘酸(polyI:C)，一种模拟病毒双链RNA而合成的dsRNA，能上调gcIFN-rel基因的表达;(5)在所分析的四个组织中， gcIFN-rel 的表达规律与gcNOD2相一致；推测IFN-和IFN-rel被细菌的产物PGN所激活可能是通过NOD2依赖的方式。四、创新点及下步研究计划四、创新点及下步研究计划1.主要创新点 （1） 首次从草鱼中克隆了胞内识别细菌的模式识别受体NOD1和NOD2基因的cDNA全长和基因组全长；（2） 对草鱼胞内模式识别受体NOD1和NOD2从mRNA水平、蛋白水平及细胞水平进行了表达或定位分析；同时，首次研究了病毒的感染对细菌模式识别受体NOD1和NOD2基因表达的影响；（3） 克隆了草鱼IFN-相关基因的cDNA全长和基因组全长，并对该基因的表达规律进行研究；首次提出了草鱼IFN-相关基因与NOD样模式识别受体在发挥功能上存在相关性。2.下步研究