1分子生物学改造学习课程

1、 在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。 通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。 蛋白质工程的主要技术之一是定点突变技术.第1页/共102页第一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。一、定点突变 利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点突变（site dir

2、ected mutagenesis）。 定点突变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。第2页/共102页第二页，编辑于星期四：二十三点 三十分。第3页/共102页第三页，编辑于星期四：二十三点 三十分。二、基因定点突变的意义 用于研究基因的结构与功能； 通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。第4页/共102页第四页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的

3、甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。第5页/共102页第五页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定

4、点突变改变蛋白质生物学活性的成功例子。第6页/共102页第六页，编辑于星期四：二十三点 三十分。加入二硫键增加蛋白质的稳定性 蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。 在一项研究中，通过寡核苷酸定点突变构建了T4溶菌酶的六种变异体,比较了它们的活性.第7页/共102页第七页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 T4溶菌酶和6种设计的变体特性 酶 氨基酸的位置 二硫键的数目 相对活性 Tm 3 9 21 54 97 142 164 (%) () wt

5、 Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0 100 41.9 pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0 100 41.9 A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1 96 46.7 B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1 106 48.3 C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1 0 52.9 D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2 95 57.6 E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2 0 58.9 F Cys Cys Cys Thr

6、Cys Cys Cys 3 0 65.9 wt：野生型T4溶菌酶；pwt:假野生型酶；AF：六种设计的半胱氨酸变体；Tm:熔点温度第8页/共102页第八页，编辑于星期四：二十三点 三十分。将Asn和Gln转换成其他氨基酸 当蛋白质暴露于高温时: 天冬酰胺（Asn） 天冬氨酸(Asp) + NH3 谷氨酰胺(Gln) 谷氨酸(Glu) + NH3 导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。 如酵母的丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的表面上，可能与该酶的热稳定性有关。 若将两个Asn全部换成Asp，则变体酶即使在常温下也不稳定，而且

7、酶活性也大为降低； 而将2个Asn分别换为苏氨酸(Thr)和异亮氨酸(Ile)，其半衰期则延长。第9页/共102页第九页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性 氨基酸位点 酶 14 78 半衰期（min） 野生型 Asn Asn 13 变体A Asn Thr 17 变体B Asn Ile 16 变体C Thr Ile 25 变体D Asp Asn 11 酶的稳定性以在100时半衰期或者失活率来表示。半衰期越长酶越稳定第10页/共102页第十页，编辑于星期四：二十三点 三十分。减少游离Cys残基的数目 在利用DNA重组技术表达外源基因时，常常会遇到这种情况：外

8、源蛋白的表达量很大，但其生物活性却很低，即外源蛋白的比活性很低。 利用蛋白质工程技术减少游离的半胱氨酸（Cys）残基数目，以减少蛋白错误折叠的可能性，从而可以提高蛋白质的生物活性。第11页/共102页第十一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 例如：当人-干扰素基因（-IFN）在大肠杆菌中表达时，尽管其表达量很高，但其比活性只及天然蛋白质的10%。 DNA序列分析显示， -IFN所编码的蛋白质有三个Cys残基，其中2个形成分子内二硫键，而另一个游离的Cys可能涉及到-IFN分子间二硫键的形成，导致二聚体的产生，使单聚体含量减少，活性降底。 将-IFN分子中的游离Cys残基用Ser来取代，因为C

9、ys与Ser分子结构相似，前者有一个S原子，而后者是一个O原子，减少了二聚体的形成，提高了活性蛋白质的得率。第12页/共102页第十二页，编辑于星期四：二十三点 三十分。增加酶的活性 用定点突变技术不仅可以提高蛋白质的稳定性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性，需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底物的亲和程度，并利用定点突变技术对蛋白质进行改造，提高酶的活性。第13页/共102页第十三页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 天然和突变酪氨酰-tRNA合成酶活性 酶 Kcat(s-1) Km(mmol/L) Kcat/Km(s-1mol-1) Thr-51

10、4.7 2.5 1.860 Ala-51 4.0 1.2 3.200 Pro-51 1.8 0.019 95.800第14页/共102页第十四页，编辑于星期四：二十三点 三十分。改变酶的特异性突变葡萄球菌核酸酶与含-SH寡核苷酸结合示意图第15页/共102页第十五页，编辑于星期四：二十三点 三十分。三、定点突变原理第16页/共102页第十六页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 第17页/共102页第十七页，编辑于星期四：二十三点 三十分。（一）M13DNA寡核苷酸突变 基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又以M13M13 和为最常用。 M13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4k

11、b，在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染型单链DNA(single stranded DNA, ssDNA) 。 当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为复制型（replication form,RF）M13（RF- M13）。 广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phage display)和单链核酸的制备。 四、定点突变的常用方法第18页/共102页第十八页，编辑于星期四：二十三点 三十分。1.基本原理 再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动M13单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸

12、引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分。 因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的DNA分子,再经表达即可获得改造后蛋白质. 为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。 第19页/共102页第十九页，编辑于星期四：二十三点 三十分。2.突变过程1)合成含有目的基因的正链DNA；2)合成含有特殊突变碱基的引物；3）制备异源双链DNA；4）富集和转化双链DNA分子；5）筛选突变体并鉴定第20页/共102页第二十页，编辑于星期四：二十三点 三十分。（二）Kunkel

13、定点突变法 体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除去,获得纯化的突变DNA。 理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡核苷酸定点突变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。第21页/共102页第二十一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。具体步骤：具体步骤： 将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入M13 DNA载载体上，导入具有体上，导入具有dUTP酶（酶（dut）和）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷）双缺陷的大肠杆菌（的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株）

14、菌株中。中。 Dut缺陷缺陷导致细胞内导致细胞内dUTP水平上升水平上升，并在并在DNA复制时，部分取代复制时，部分取代dTTP进进入入DNA新生链中。又由于新生链中。又由于ung缺陷缺陷使掺入使掺入DNA的的dUTP残基不能除去残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链单链DNA大约有大约有1%的的T被被U所取代所取代，然后进行然后进行DNA定点突变。定点突变。 双链双链DNA导入正常的大肠杆菌中，导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶其尿嘧啶N-糖基化酶除去糖基化酶除去DNA链链上的尿嘧啶碱基。上的尿嘧啶碱基。 结果原来的结果原来的M13模板链被降解，模板链被降解，只

15、有突变链因不含只有突变链因不含U，被保留下，被保留下来。这种方法产生的来。这种方法产生的M13噬菌体噬菌体中含有突变中含有突变DNA的比例大大增加。的比例大大增加。第22页/共102页第二十二页，编辑于星期四：二十三点 三十分。（三） PCR定点突变 Polymerase Chain Reaction （PCR）是一种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化的模拟。PCR技术的原理是DNA半保留复制。首创。第23页/共102页第二十三页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 PCR进行寡核苷酸定点突变的示意图 第24页/共102页第二十四页，编辑于星期四：二十三

16、点 三十分。1 1、重叠延伸、重叠延伸PCR PCR （OE-PCROE-PCR） 首先设计两个首先设计两个PCRPCR反应以产生两个含突变位点的反应以产生两个含突变位点的DNADNA片段，随后将上述片段，随后将上述两个两个PCRPCR产物混合，二者通过产物混合，二者通过末端互补区结合末端互补区结合并在适宜的温度下并在适宜的温度下互为引物延互为引物延伸伸得到完整的含突变的基因，对第一次得到完整的含突变的基因，对第一次PCRPCR产物进行纯化处理可显著提高突产物进行纯化处理可显著提高突变效率变效率第25页/共102页第二十五页，编辑于星期四：二十三点 三十分。第26页/共102页第二十六页，编辑

17、于星期四：二十三点 三十分。2 2、大引物、大引物PCRPCR法法（megaprimer PCR )megaprimer PCR ) 先设置一个先设置一个PCRPCR反应产生一个含突变的反应产生一个含突变的DNADNA片段，然后再以此片段，然后再以此DNADNA片段作为引物与片段作为引物与原模板退火进行原模板退火进行PCRPCR扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的DNADNA片段较片段较通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物PCRPCR法。法。 第27页/共102页第二十七页，

18、编辑于星期四：二十三点 三十分。大引物大引物PCR PCR 定点突变技术路线定点突变技术路线（圆点指突变位点）第28页/共102页第二十八页，编辑于星期四：二十三点 三十分。3 3、环状突变、环状突变 PCR PCR 法法定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用突变剂进定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用突变剂进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。方法：方法：两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平末两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平末端的线性端的线性DNADNA，需用，需用T4T4连接酶环化处理。连接酶环化处理。以以Strat

19、ageneStratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表，公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其两个引物也是反向的并且其5 5端有端有l5l5个碱基以上的个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNADNA，可自行环，可自行环化。化。第29页/共102页第二十九页，编辑于星期四：二十三点 三十分。环状突变环状突变 PCR PCR 法法第30页/共102页第三十页，编辑于星期四：二十三点 三十分。环状突变环状突变 PCR PCR 法法第31页/共102页第三十一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。第32页/共102页第三十二页，编辑于

20、星期四：二十三点 三十分。第33页/共102页第三十三页，编辑于星期四：二十三点 三十分。第34页/共102页第三十四页，编辑于星期四：二十三点 三十分。通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性第35页/共102页第三十五页，编辑于星期四：二十三点 三十分。通过引入二硫键提高蛋白的稳定性 蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即形成二硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。第36页/共102页第三十六页，编辑于星期四：二十三点 三十分。通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性应用举例：大肠杆菌碱性磷酸酶应用

21、举例：大肠杆菌碱性磷酸酶第37页/共102页第三十七页，编辑于星期四：二十三点 三十分。E.coli Alkaline phosphatase: Wild Type D101SAsp101Ser101第38页/共102页第三十八页，编辑于星期四：二十三点 三十分。q易错易错PCR（Error prone PCR）qDNA改组（改组（DNA shuffling）第39页/共102页第三十九页，编辑于星期四：二十三点 三十分。v易错 PCR（error-prone PCR）是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率,降低聚合酶固有的突变序列倾向性,提高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地

22、以一定的频率掺入到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合适的载体克隆突变基因。v连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。第40页/共102页第四十页，编辑于星期四：二十三点 三十分。方法：l增加MgCl2浓度到7mM,稳定非互补的碱基配对l增加聚合酶量到5U,促使在错配碱基处继续延伸反应l降低一种dNTP的量（降至1-10）.在缺乏正确核苷酸时,聚合酶经短暂停留后,会插入另外3种可用核苷酸的一种l加入次黄嘌呤dITP来代替被减少的dNTP,能与C、T、A配

23、对l缓冲液中另加0.5mmol/L MnCl2, Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性l增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误掺入l使用突变DNA聚合酶如Mutazyme GCAT第41页/共102页第四十一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。易错PCR(epPCR) 第42页/共102页第四十二页，编辑于星期四：二十三点 三十分。DNA改组（DNA Shuffling）又称DNA“洗牌”,或DNA体外随机拼接技术,它依赖PCR,又不完全等同于传统的PCR技术,所以,DNA体外随机拼接又称为有性PCR。指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombin

24、ation)。通过改变单个基因(或基因家族，gene family)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。第43页/共102页第四十三页，编辑于星期四：二十三点 三十分。DNA shuffling体外基因突变一般过程如下 (1)获得目的基因:选择一组分别具有一系列所需性状的基因序列作为重组的亲本,亲本之间有序列同源性(60%).亲本可以是经随机诱变得到的一组有益突变体,或天然存在的基因家族.常用的有两种方法。n为了增加突变率采用PCR扩增目的基因回收n为了增强保真性，可以采取抽提含有目的基因的质粒，通过酶切回收。第44页/共102页第四十四页，编辑于星期四：二十三点 三十分。(

25、2)基因酶切回收:采用DNase I消化基因DNA得到10-50 bps或100-300 bps的片段，酶切过程中用Mn2+能提高保真性3倍左右。(3)无引物PCR:切割的DNA片段通过相互间的同源随机互补并互为引物,经PCR扩增,获得大量随机组合的新DNA突变体.为确保得到高保真性的片段，应在较高的温度下复性。同标准PCR,先对dsDNA进行热变性,退火时单链片段与足够长度互补序列的其它单链配对,形成3或5突出端,聚合酶延伸3凹端.反复循环，随着循环数增加,片段的平均长度也增加,最后达到DNA亲本序列的原始长度.第45页/共102页第四十五页，编辑于星期四：二十三点 三十分。(4)有引物PC

26、R:将无引物PCR产物作适当稀释，作为模板进行PCR，加入特定两侧引物进行最后的PCR扩增,便可获得全长基因的PCR产物。(5)目的突变基因的获得:回收目的片段克隆到载体上，转化选择所需的突变了的目的基因。如筛选抗性基因、高酶活基因等第46页/共102页第四十六页，编辑于星期四：二十三点 三十分。DNase处理无引物PCR 片段重装配3355355355335533反复循环第47页/共102页第四十七页，编辑于星期四：二十三点 三十分。有引物PCR克隆筛选第48页/共102页第四十八页，编辑于星期四：二十三点 三十分。DNA Shuffling技术能模拟生物的基因在数百万年间发生的分子进化过程

27、，并能在短期的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高成千上万倍的功能性突变基因。项目项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向常规定向进化进化缓慢缓慢进化进化整个基因整个基因组组多年多年完整基因完整基因组组高高DNAShuffling快速快速进化进化特定基因特定基因/操纵子操纵子/病病毒毒几天几天部分基因部分基因组组低低DNA Shuffling与常规定向进化的比较第49页/共102页第四十九页，编辑于星期四：二十三点 三十分。实例:1994年，美国的Stemmer采用单个基因的DNA Shuffling和回交技术，在大肠杆菌中使编码-内酰胺酶的TEM-I基因的抗生素抑制活

28、性(MIC)从0. 02ug/mL提高到640ug/mL,即提高了32, 000倍。次后，他们又相继选取了绿色荧光蛋白基因(gfp)和-半乳糖昔酶基因(lac) (1997)用DNA Shuffling技术模拟并加速了分子进化过程。筛选获得了酶活性大幅度提高的突变株1996年，Moore等亦采用该技术对降解污水中有机污染物的对硝基苄基酯酶基因进行了定向模拟分子进化研究。1998, Crameri等采用4个不同来源的先锋霉素基因混合进行异源基因组的DNA Shuffling，使单一循环的MIC活性提高了270-540倍。而同时只用单一基因进行的实验仅提高了8倍。第50页/共102页第五十页，编辑

29、于星期四：二十三点 三十分。交错延伸重组（staggered extension process，StEP）将DNA Shuffling技术进一步改进的DNA体外重组技术核心技术:有性PCR,在一个反应体系中以2个以上有一定序列同源性的DNA片段为模板进行PCR反应,通过变换模板机制实现DNA序列的重新组装第51页/共102页第五十一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。交错延伸重组的一般过程如下 (1)获得目的基因:选择两个以上有一定序列同源性的分别具有优良性状的亲本基因作为PCR模板n省去用DNase将DNA切割成片段及片段纯化步骤,简化了程序(2) 短暂PCR反应 在每轮循环中,退火和延伸

30、反应控制在短暂的时间(5s),引物先在一个模板链上延伸,只能合成出很短的新生链.经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火后继续进行短暂的延伸,此过程反复进行,直到产生全长的基因,得到间隔地含不同模板序列的杂交DNA分子.第52页/共102页第五十二页，编辑于星期四：二十三点 三十分。(3)两端引物PCR:加入两端引物作标准PCR反应,扩增全长的杂交DNA链。(4)目的突变基因的获得:回收目的片段克隆到载体上，从得到的DNA文库中选择或筛选得到性状优化的基因第53页/共102页第五十三页，编辑于星期四：二十三点 三十分。第54页/共102页第五十四页，编辑于星期四：二十三点 三十分

31、。随机引发重组（ random-priming recombination，RPR ）原理:用一套随机引物与模板配对延伸,产生互补于模板不同位点的短DNA片段混合物,由于碱基的错配和错误引发,这些短的DNA片段中也会有少量点突变,在随后的PCR反应中,这些短的DNA片段互为引物重新组装产生全长的基因模板:一条DNA单链或cDNA第55页/共102页第五十五页，编辑于星期四：二十三点 三十分。随机引发重组的一般过程如下 (1)随机引发合成短DNA片段混合物:以变性DNA为模板,加入随机引物,用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段进行延伸反应,得到长短不一的新生DNA片段(50-500bp)(2)

32、 过滤、纯化DNA片段混合物 去除模板、长的新生DNA片段、小的新生DNA片段（30bp），蛋白质和引物.(3)无引物PCR.新生DNA片段互为引物,重新组装产生全长的杂交DNA链(4)标准PCR 加入特异的两端引物第56页/共102页第五十六页，编辑于星期四：二十三点 三十分。第57页/共102页第五十七页，编辑于星期四：二十三点 三十分。三、基因融合和基因剪接三、基因融合和基因剪接1 1利用基因融合技术表达外源基因的缘由利用基因融合技术表达外源基因的缘由2 2基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体3 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接蛋白质内含子介导的蛋白质分

33、子间的连接第58页/共102页第五十八页，编辑于星期四：二十三点 三十分。利用基因融合技术表达外源基因的缘由利用基因融合技术表达外源基因的缘由 外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解降解 通过与特异蛋白质或特异的结构域形成通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白融合蛋白，利于快，利于快速回收、纯化速回收、纯化 融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白 通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成在细胞内形成包涵体包涵体 基因融合是对基因进行

34、改造的手段，广泛用于蛋白质结构基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的研究功能的研究第59页/共102页第五十九页，编辑于星期四：二十三点 三十分。基因融合的策略基因融合的策略将重组基因直接剪接于适当的将重组基因直接剪接于适当的信号肽信号肽之后之后将外源基因本身按将外源基因本身按阅读框架阅读框架自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重要性非常重要目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C C端或端或N N端融合端融合第60页/共102页第六十页，编辑于星期四：二十三点 三十分。为蛋白质的表达和纯

35、化提供方便为蛋白质的表达和纯化提供方便 研究蛋白质的定位及移动研究蛋白质的定位及移动控制蛋白质固定的空间取向控制蛋白质固定的空间取向构建具有双催化活性的融合蛋白或融合酶构建具有双催化活性的融合蛋白或融合酶防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GSTGST蛋白表达的空间定位：信号肽蛋白表达的空间定位：信号肽第61页/共102页第六十一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。接头（接头（linkerlinker）的设计）的设计 长度：过长对蛋白裂解敏感，免疫原性增加；过短影响蛋白折叠 常用非极性的疏水氨基酸：构象广

36、泛，有利于运动；体积小有利于堆积 单链抗体（scFv）第62页/共102页第六十二页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 生化反应常常需要多酶顺序催化来进行，称为顺序酶反应（Sequence enzyme reaction）。大量的研究表明，通过基因融合构建具有双酶活力的融合蛋白，可有效提高顺序酶反应的总转化效率。 第63页/共102页第六十三页，编辑于星期四：二十三点 三十分。黑曲霉葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)曲霉糖化酶(Glucoamylase,GA) 第64页/共102页第六十四页，编辑于星期四：二十三点 三十分。GOD subunitGOD subunitGAG

37、AGLG fusion enzymeLinkerpeptideTranslated fusion peptide chains Expressed fusion enzyme(Ser-Gly)第65页/共102页第六十五页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为“亲和尾”（Affinity tail）的编码序列相连接，这段“亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。融合蛋白标签 第66页/共102页第六十六页，编辑于星期四：二十三点 三十分。含配体溶液

38、含配体溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样品混合蛋白样品平衡液平衡液带有配体的树脂珠带有配体的树脂珠（或胶粒）（或胶粒）第67页/共102页第六十七页，编辑于星期四：二十三点 三十分。融合标签的功能融合标签的功能 蛋白纯化 蛋白质的检测和定向固定 体内生物事件的可视化 提高重组蛋白质的产量 增强重组蛋白质的可溶性及稳定性 第68页/共102页第六十八页，编辑于星期四：二十三点 三十分。融合蛋白融合蛋白报告分子报告分子 将易于检测的蛋白质与目的分子融合表达，可显示目标分子的存在和定位，广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选 第69

39、页/共102页第六十九页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP) )是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。其内源发光基团在受到紫外或蓝光激发时，可高效发射绿光，且无需底物和辅因子。GFP可作为一种“荧光标签”被用来研究目标蛋白的定位及移动情况。 第70页/共102页第七十页，编辑于星期四：二十三点 三十分。qGreen-GFPqblue-BFPqCyan-CFP qRed-RFPqYellow-YFP第71页/共102页第七十一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。各色荧光蛋白对细菌的标记 The d

40、iversity of genetic mutations is illustrated by this San Diego beach scene drawn with living bacteria expressing 8 different colors of fluorescent proteins. 2008年，科学家将多种色彩的荧光蛋白质植入细菌的DNA分子结构中。在细菌体内植入荧光蛋白可以观测这些细菌的生命机理是如何运行的。第72页/共102页第七十二页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 脑内连接 这张图片出自杰夫利希曼(Jeff Lichtman)之手，展现了大脑内的连接，图

41、片中美丽的“彩虹”就是神经系统网络。连线杂志网站曾于2007年刊登这张图片。第73页/共102页第七十三页，编辑于星期四：二十三点 三十分。神经干细胞 这张不太拥挤的图像表明干细胞是如何在空间排列自己的。神经干细胞的细胞核被染为了绿色，另一种细胞星细胞则表现为红色。 第74页/共102页第七十四页，编辑于星期四：二十三点 三十分。荧光鱼 在约克镇科技公司将荧光鱼引入市场后不久，荧光蛋白便迅速在商业上得到应用。在美国，读者可以在加利福尼亚以外的任何一个州购买到荧光鱼。(来源：新浪科技/孝文)第75页/共102页第七十五页，编辑于星期四：二十三点 三十分。GFP在肿瘤发病机制研究中的应用GFP 是

42、一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合,将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水平,显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化,为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。第76页/共102页第七十六页，编辑于星期四：二十三点 三十分。荧光绒毛 2008年绿色荧光蛋白成为诺贝奖的大赢家。这张图片就是用诺贝尔奖技术炮制的小肠绒毛图片，小肠绒毛是凸出于小肠的细小手状结构，具有吸收食物营养的功能。科学家将红色荧光蛋白标记导入小肠绒毛细胞中，展现出带有荧光标记的小肠绒毛。第77页/共102页第七十七页，

43、编辑于星期四：二十三点 三十分。真皮成纤维细胞 成纤维细胞制造胶原蛋白，在体内充当脚手架的作用，支持其它细胞呆在适当的位置，同时让其它化学物质“沐浴”这些细胞。 图像中的这些细胞来自人体皮肤，被用于研究病毒是如何透过皮肤入侵人体的。 为帮助了解这些病毒壳在做什么，科学家让它和绿色荧光蛋白结合，从而使它呈现为绿色。成纤维细胞的肌动蛋白被染为了红色，DNA则为蓝色。第78页/共102页第七十八页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 有机磷水解酶（Organophosphorus hydrolase, OPH）能够降解许多种有机磷农药。将GFP基因与OPH基因的5端融合，构建GFP-OPH融合基因，并

44、将其在大肠杆菌中表达。经IPTG诱导后，绿色荧光直接可见，融合蛋白同时保持了OPH 和GFP的生物活性。此外，由于GFP的荧光强度与OPH活力成正比，还可通过荧光强度的检测对OPH进行定量分析。 第79页/共102页第七十九页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 控制某一代谢途径的相关基因, 紧密连锁地排列在一起.Lac operon I p o Z Y Aoperon I:调控基因 P:启动子 O:操纵基因 第80页/共102页第八十页，编辑于星期四：二十三点 三十分。乳糖代谢的条件乳糖代谢的条件E. coli: “This is my favorite!”乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖第8

45、1页/共102页第八十一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。如何利用乳糖如何利用乳糖E. coli: “I needlactose permease,-galactosidase, andtransacetylase.”第82页/共102页第八十二页，编辑于星期四：二十三点 三十分。何时利用乳糖何时利用乳糖E. coli: “I will use lactose only when there is no glucose and there is lactose.”Glucose + Lactose +Glucose Lactose Glucose Lactose +第83页/共102页第八十

46、三页，编辑于星期四：二十三点 三十分。乳糖操纵子的结构乳糖操纵子的结构The lac operon第84页/共102页第八十四页，编辑于星期四：二十三点 三十分。大肠杆菌乳糖操纵子 乳糖操纵子控制模型的主要内容： Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码； 启动区P位于阻遏基因I与操纵区O之间； 操纵区是DNA上的一小段序列，是阻遏物结合的位点； 当阻遏物与操纵区结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制； 诱导物通过与阻遏物结合，改变其三维构象，使之不能与操纵区结合，使lac mRNA能够合成。第85页/共102页第八十五页，编辑于星期四：二十三点 三十分。第86页/共102

47、页第八十六页，编辑于星期四：二十三点 三十分。第87页/共102页第八十七页，编辑于星期四：二十三点 三十分。第88页/共102页第八十八页，编辑于星期四：二十三点 三十分。乳糖操纵子乳糖存在但是葡萄糖不存在的情况RepressorPromoterLacYLacALacZOperatorCAPBindingRepressorRepressor mRNAHey man, Im constitutiveCAPcAMPLacRepressorRepressorXThis lactose has bent me out of shapeCAPcAMPCAPcAMPBind to mePolymeras

48、eRNAPol.RNAPol.Yipee!第89页/共102页第八十九页，编辑于星期四：二十三点 三十分。蛋白质剪接 原理：由蛋白质内含肽所介导。是一个蛋白质翻译后的加工过程，它由一系列分子内的剪切-连接反应组成。 蛋白质内含肽是一个蛋白质前体中的多肽序列，可以催化自身从蛋白质前体中断裂，使两侧的蛋白质外显子连接成成熟的蛋白质。 第90页/共102页第九十页，编辑于星期四：二十三点 三十分。 利用内含肽载体致力生物合成利用内含肽载体致力生物合成C-S酯酯键肽链或键肽链或N-半胱氨酸肽链半胱氨酸肽链 内含肽介导的异源蛋白质体外连接内含肽介导的异源蛋白质体外连接 用反式剪切技术实现蛋白质体内、体外用反式剪切技术实现蛋白质体内、体外连接连接 双内含肽介导的蛋白质自身环化及蛋白双内含肽介导的蛋白质自身环化及蛋白多聚体的生成多聚体的生成内含肽的应用intein 第91页/共102页第九十一页，编辑于星期四：二十三点 三十分。自18世纪至今，在诸多研究者不断进取的努力下，胰岛素的研究经历了五个阶段：