动(植)物疫病防制高技术原理与方法

1、 动（植）物疫病防制高技术原理与方法 免疫胶体金技术的应用及展望摘 要: 免疫胶体金技术是继三大标记技术( 荧光素、放射性同位素 和酶) 后发展起来的固相标记免疫测定技术。免疫胶体金标 记技术是以胶体金作为示踪标志物, 应用于抗原抗体反应 的一种新型免疫标记技术。近年来, 该技术在医学、动植 物检疫、食品安全监督等各领域得到了日益广泛的应用。从 胶体金技术的基本原理、制备方法、标记技术、应用现状 及其优点等方面作一简要综述, 并对该技术的发展前景作 了展望。关键词: 免疫胶体金技术 应用 展望Prospect and Application of Immune Colloidal Gold T

2、echniqueAbstract： Immune colloidal gold technique is a solid immune diagnostic technique developed in the base of three label technique( Luciferin, radio active isotope and enzyme), and it is a new immune label technique applied to the detection of antibody and antigen.Lately, the technique is widel

3、y applied to the scopes, such as medical ,animal and plant quarantine and the surve illance of food safety.The article summarized the basic principle, producing method, label techn ique and advantage of immune colloidal gold technique and discussed the existent problems and the future developmental

4、trend of the technology.Key words: Immune colloidal gold technique App lication Prospect 免疫胶体金技术( Immune collo idal go ld technique, ICG )是一种常见的标记技术, 它是以胶体金为标记物, 利用特异性抗原抗体反应, 在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术, 是继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。胶体金最早由法拉第发现于1857年, 他用还原法从氯金酸水溶液中制备胶体金, 并发现在其中加入少量电解质

5、后, 可使胶体金由红色变为蓝色, 最终凝集成无色, 而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化, 他的重大发现奠定了胶体金制备和应用的科学基础。1971年Faulk和Tay lon 1 首次用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合、制备成金标抗体检测细菌表面抗原的分布。1974年, Romano 等 2 用胶体金标记抗球蛋白抗体, 建立间接免疫金染色法。此后, 胶体金作为一种新型免疫标记技术得到很快发展。1980年, G eoghegan 3 应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原, 建立了光镜水平的免疫金技术( immunogold sta in ing ,IGS)。D anscher 4 在此基

6、础上改进并发展了用银显影液增强光镜金颗粒可见性的免疫金染色法( immunogoldsta in ing, IGSS)。Ho lgate 5 又对上法加以改进, 将免疫金染色与银显影技术相结合, 建立免疫金银染色法( immunogo ld silver staining, IGSS)。近年来, 研究人员根据胶体金的物化性质进一步拓展了基于胶体金标记的生物检测技术及胶体金在其他生物学方面的应用。目前已广泛应用于被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、流式细胞术、液相免疫测定、斑点金免疫渗滤及免疫层析等, 其中在医学检验中的应用主要是免疫层析法( immuno-chrom atographic ass

7、ay, ICA )和快速免疫金渗滤法( Do-t immunogold filtration assay, DIGFA )。免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,因其快速简便、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点已在人医的临床检验和其它领域取得广泛的应用, 如妊娠试验、传染病病原抗体的检测、蛋白质的检测和药物测定等, 该技术在兽医临床上的应用也益广泛。 1.胶体金技术的基本原理 氯金酸(HAuCl4 )在还原剂作用下, 可聚合成一定大小的金颗粒, 形成带负电的疏水胶溶液, 由于静电作用而成为稳定的胶体体系, 故称胶体金。胶体金颗粒散在, 直径从几纳米到几十纳米不等, 由

8、于不同直径的胶体金的光散射各异, 所以其溶胶颜色的深浅相应发生显著的变化, 这就是胶体金用于被动凝集试验的基础。胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程, 吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷, 与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒, 这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能, 可以与葡萄球菌A 蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多种物质非共价结合, 从而使其成为免疫反应的优良标记物。免疫胶体金颗粒具有高电子高密度的特性, 在显微镜下金标蛋白结合处, 可见黑褐色颗粒, 当这些标记

9、物在相应的配体处大量聚集时, 肉眼可见红色或粉红色斑点, 因而可用于定性或半定量的快速免疫检测, 而且金颗粒还可催化银离子还原成金属银, 因此在胶体金免疫测定时加入银染色液, 能放大反应信号,大大增加测定的灵敏度。 2.免疫胶体金的制备2.1胶体金的制备 胶体金的制备一般采用还原法，常用的还原剂有柠檬酸、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。其原理是利用还原剂将氯金酸溶液中的金离子还原成金原子，根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备5150nm不等的胶体金，一般还原剂用量越大制备的胶体金颗粒越小。最常用的制备方法为柠檬酸钠还原法。操作过程如下：取100ml 0.01%的氯金酸（HAuCl）水溶

10、液用水浴磁力搅拌锅加热至沸腾，在磁力搅拌器以一定转速不断搅拌下迅速加入所需的1%柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热约15min至溶液颜色稳定不变。胶体金准备过程要求所用玻璃容器必须绝对清洁，玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，产生凝集颗粒，因此玻璃器皿用前要经过泡酸、超声洗涤处理，并用蒸馏水、超纯水依次冲洗浸泡，然后烘干备用。2.2胶体金的标记 由于胶体金颗粒在电解质中不稳定，制备后应立即用大分子（如蛋白质）进行标记。胶体金颗粒对蛋白质的吸附作用取决于pH值。在pH值=pI值时，蛋白质溶解度最小，最容易吸附到疏水的金颗粒表面，但在实际操作中，一般胶体金溶液的pH值调到稍高于标记用蛋白质的pI

11、值，这样蛋白质带正电，结合更稳定，可用0.1molL 或是0.1molLHCl调节胶体金溶液的pH至选定的值，但是通常最适反应pH往往需经过多次试验才能确定，在调节pH值时，胶体金会阻塞pH计的电极，因此可用普通pH试纸先调节到目标pH值附近再换用精密pH试纸调节6，也可以用胶体金专业pH计调节pH。标记应在磁力搅拌下，逐滴加入待标记蛋白质溶液，混匀30min后继续在磁力搅拌下加入10%BSA,使其终浓度为0.5%,搅拌混匀15min再加入5%PEG20000至终浓度为0.1%，再持续搅拌混匀15min最后4静置过夜。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶

12、液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子浓度的双蒸馏水透析去盐，并通过离心及微孔滤膜过滤以除去细小颗粒，然后通过系列稀释法找出能使胶体金稳定的待标记蛋白质的最低浓，这一浓度再加10%即为最佳标记蛋白质量。标记好的胶体金还应加入终浓度为0. 05% -0.1% 的PEG 6000 或PEG 20000 作为稳定剂 7 。多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂, PEG和BSA 是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用, 一为保护胶体金的稳定性, 使之便于长期保存; 二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择十分重要, 不适当的稳定剂有时也会导致非特异性

13、反应。2. 3 胶体金标记后的纯化 标记好的胶体金中往往还含有未结合的蛋白质、未充分标记的胶体金以及标记过程终形成的各种聚合物。因此标记好的胶体金还需经过纯化才能使用, 一般纯化方法有离心法和凝胶过滤法等。采用离心法时, 一般颗粒10 nm以上的胶体金可高速离心, 颗粒小于10 nm 的胶体金要用超速离心, 在4离心15m in至1 h不等, 弃上清, 沉淀用原体积的0. 02mo l/L TBS pH8. 2(含1% BSA, 0. 05% 叠氮钠)溶解, 重复离心2- 3 次, 沉淀溶于原体积的1/10 PBS 溶液中, 4 保存备用。凝胶过滤法为纯化免疫胶体金的最好方法, 过滤的胶体金颗

14、粒比较均匀, 不容易凝集, 而离心法转速高, 时间长, 胶体金颗粒沉淀后容易凝集, 用凝胶过滤法克服了这一弱点。将浓缩好的免疫胶体金先以1 500 r /m in离心除去大的聚合物, 取上清液过柱。可用Sephacryls-400或Sepharose-4B (或6B)装柱, 0. 02mol /L TBS pH 8.2平衡和洗脱 6 。免疫胶体金技术3.免疫渗滤试验（）技术8 其基本原理是以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细管虹吸作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物（或其他）指示剂之反应形成红色的可见结果。3.免疫层

15、析9（）试验技术 其原理是将特异的抗体或抗原先固定于硝酸纤维素（）膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品尿液或血清后，由于毛细作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体或抗原的区域时，样品中相应的抗原或抗体即与该抗体或抗原发生特异性结合，再通过标记技术使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。胶体金免疫层析（）就是利用胶体金本身的显色特点结合免疫层析技术诊断特异性的待测物。同样是层析法的金标纸条，根据胶体金标记的东西不同可以分成间接法、竞争法和双抗原夹心法等不同种类。 免疫胶体金的应用1免疫胶体金标记技术在植物方面的研究应用4.植物病害超微病理的研究10 利用免疫电镜技术

16、研究植物病害的超微病理，其原理是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨率相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析。特异性抗体用铁蛋白、胶体金或过氧化物酶标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物的所在位置，即为抗原抗体的反应部位。年，李红叶11等利用免疫胶体金标记技术检测寄主体内的葡萄扇叶病毒（）移动蛋白，进一步证实了是通过管状结构实现细胞问移动的。彭日荷12等同样利用此技术研究了甜菜多粘菌传带甜菜坏死黄脉病毒的部位。4.植物病害的快速检测 利用胶体金免疫层析法和斑点渗滤法可准确、灵敏、快速地检测植物病害，并具有操作简便的特点，克服了传统鉴定方法时间久、操作

17、程序复杂、无法及时诊断潜伏侵染的病害等缺点。4.植物病原物互作的研究 利用基因芯片技术植物病原互作的分子机制，尤其是在检测与病害发生发展有关的植物病原物互作基因方面有着美好的前景。基因芯片技术是指通过微阵列技术将告密度片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，标记 探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。利用胶体金标记寡聚核苷酸，制备探针，应用于基因芯片技术。将捕获固定到玻片基质上，加入胶体金标记寡聚核苷酸探针，如互补则可发生特异性结合，经银加强技术后，通过显微镜或肉眼可直接观察到结果。4.转基因植物产品的检

18、测 以转基因植物中外源目标基因表达的产物为抗原，制备其特异性抗体，用胶体金标记抗体，制作免疫层析试纸条或斑点渗滤试剂盒，可快速、灵敏地检测转基因植物产品，并可通过定量或半定量技术初步鉴定其质量。4.胶体金免疫在植物检疫上的应用 由于以膜为固相载体的免疫胶体金快速诊断技术即免疫层析技术和斑点渗滤技术可检测各种细菌、真菌、病毒等植物病害，且具有快速、灵敏、特异性强、操作简便可大批量地检测样品等优点可用于跨区域引种、调种及海关的植物检疫。4.免疫胶体金在动物方面研究应用4.免疫胶体金在病毒害检测中应用 胶体金免疫层析技术在动物检疫工作中广泛用于诸如猪瘟、蓝耳病、细小病毒病等传染病病源微生物的抗原、抗

19、体检测，也可用于一些违禁和超量使用激素如性激素残留的检测。此外，该技术还可用于其它一些微量物质的检测，如抗生素残留检测等。胶体金免疫层析作为一种可靠的免疫学检测技术，特异性强、灵敏度高、简便快速、无需特殊仪器设备，在动物检疫实际工作中有广泛应用价值。4.免疫胶体金技术在禽病13诊断中的应用 随着世界范围内养禽业的规模不断扩大，禽病对养殖的危害也随之加剧。对家禽疾病进行有效防治的关键是快速准确地进行诊断并弄清致病因子。伴随着病原检测技术的进步，免疫胶体金技术以其快速，简便，可单份检测，灵敏度高，特异性强，稳定性好，检测标本种类多等优点开始被逐渐应用于禽病的病原诊断。例如：王长美等用免疫胶体金试验

20、诊断发病率高、死亡快、疑似禽型副粘病毒感染的鹅病例结果为禽流感阴性，根据临床症状和病变情况、免疫胶体金试验以及病毒分离和鉴定，证明该鹅群患禽型副粘病毒病，实现了对禽型副粘病毒病的快速鉴别诊断。4.昆虫病理学研究 利用免疫胶体金标记技术同免疫电镜技术、基因芯片技术等实验技术结合将会给在组织细胞学、分子生物学水平上阐明昆虫病理的本质问题带来光明的前景。4.介体传毒识别传毒机理的研究 以免疫胶体金为标记物的组织细胞学定位技术研究病毒介体互相识别的分子细胞学过程，可揭示介体识别传毒专化性的分子机理，为植物抗病毒生物工程及用药物处理病毒受体的介体途径防治病毒病提供科学依据。4.免疫胶体金快速检测技术在临

21、床中的研究应用 早孕诊断14用的免疫层析试纸条（通常又叫尿妊纸条）是一个成功的例子，等人用免疫层析法检测粪便中的霍乱弧菌，得到了理想的效果。王中力等人用自制的犬细小病毒（）试纸条检测抗原，具有简单、快速、准确等优点。李兆隆等15研制了检验人精浆特异蛋白的免疫胶体金试纸条，主要用于法医物证检验。曲萌等16采用胶体金标记鼠抗人 单克隆抗体制成免疫层析试纸条，检测肝炎病毒 抗体。4.免疫胶体金在生物传感器上的研究及应用17 近年来金标记被引入生物传感器中的应用研究增多。 等通过交流电导法检测了在叉指电极上的金标记的免疫凝集，从而实现了胶体金免疫层析试验的电化学检测方法，并且通过在胶体金上包被导电聚合

22、物聚苯，提高电导法测定金标免疫反应的灵敏度。年等在标记胶体金标记蛋白的基础上，制作了诊断森林脑炎的电化学免疫传感器检测血清中的森林脑炎抗体及其浓度，应用胶体金催化性质的修饰酶生传感器的电极表面。等基于铂金电极修饰的胶体金提高了生物传感器检测表面抗体敏感性和稳定性。 等用基于胶体金表面等离子共振效应的电感受器测定胃蛋白酶的亲和常数。免疫胶体金技术存在的问题及应用展望 存在问题：（）胶体金颗粒大，渗透能力相对较差；（）在操作过程中要求清洁程度高；（）胶体溶液的稳定性较差，这些问题导致免疫胶体金技术的应用受到一定限制。免疫胶体金技术是基于酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、免疫胶体金技术

23、18和新材料技术的新型技术，具有便捷、灵敏、安全、低成本等特点，在诊断领域中迅速推广，已日趋成熟。免疫胶体金技术目前和今后的研究趋势有个方面：进一步提高检测灵敏度19；实现检测多元化可采用在同一膜上作多种项目测定和多项目的组合测定种方式，一次检测可同时得到一组结果，这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值；实现定量或半定量检测20。参考文献 1FaulkW, Taylorn GM. An irm nun oco lloid al goldm eth od for the electronm icroscope. Imm unoch em istry, 1971, 8: 1081-10

24、87. 2Rom an o EL, S tol inski C, H ughes-Jon esNC. An an tig lobal in reagen tlab elledw ith colloidal go ld for use in electronm icroscopy. Immunochem, 1974, 11 ( 8) : 521-522. 3GecheganWD. Passiver gold agglu tinat ion-an alternative to passiveh em agglut ination. Imm nolM ethods, 1980, 34: 11. 4 Danscher G, Norgaard JO. Light m icroscop ic visual izalion of collo-id algo ld on res in-emb edden tissu e. JH istochem Cytoch em, 1983, 31( 12) : 1394-1398.