兔出血症病毒分离鉴定VP60基因克隆及RTPCR检测方法的建立

1、四川农业大学硕士论文 屮文摘要 兔出血症（rabbi t hemorrhagi c d i s e a s e , rhd）是由兔出血症病毒（r h d v）引起的兔的急性高度 接触性传染病，给养兔业造成巨大的经济损失，为了在生产中防制该病，有必要对 毒株进行分离鉴定及其特性研究，以及建立一种灵敏、准确的检测方法.本研究从 兔病料中分离鉴定岀了3株有不同血凝性的兔出血症病毒，分别命名为p 3_i d vi h n- 1 , 2 , 3 ,毒株经兔体传至3代后，能引起rhdv抗体为阴性的家 兔发病及死亡呈现稳定的规律性.其中一 h n . 2株血凝效价为1 ： 6 4 0 ,曲f r 1 , 3

2、的血凝效价仅分别为1 ： 5, 1 : 1 0 ,但琼扩实验及对流免疫电泳均能 看到清晰的沉淀线，电镜负染可见大量球形，核心密度不同、大小约3 0 hm的病 毒粒子.根据g e n b a n k中的舶v的全基因序列，设计1对长为2 9 b p的引 物，在两引物的5,端加入e c o r i和x b a i酶切位点，对兔出血症病毒v p 6 0基因进行rt pcr扩增，扩增出约1. 7 k b的衣壳蛋白vp6 0基因的完 整片段，将其插入克隆载体p md 1 8 t上，构建重组质粒p mh p 6 0-1, 2, 3,对重组质粒的测序显示，v p 6 0基因全长1 7 4 0 b p ,共编码

3、5 7 9 个氨基酸，并在g e n b a n k中注册（發录号分别为d q 0 6 9 2 8 0 , d q 0 692810 dq069282 ）将3株跚d v及卅界上其它rhd v,以及r c v, ebhs v的vp 6 0基因序列进行多序列比对，结果显示一 h r r 1与w h n 2同源性为96. 1%, w h r r 1与whn 3同源性为9 6 . 5 %, w h n-2与whn 3同源性为9 9 . 4 %,比对序列中所有rhdv与rcv的 同源性为8 4 . 7 % 8 6 . 4 %，与e b h s v的同源性为6 9 . 0 % 7 0 . 5 %, 而p

4、3 1 d v各毒株z间同源性为8 9 . 7 5 3 9. 4 %,表明vp6 0是一个 很保守片段.在遗传迓化上，世界各地的rhdv毒株在核昔酸水平上趋向4个支 谱系，在氨基酸水平上趋向3个支谱系，谱系问没有明显的地理或时i闻特征，r hdv i h n-1 , 2 , 3株分布在2个不同的谱系中，与咖v为同一属的e b h sv和rc 1分别组成两支不同的谱系，以上结果对认识rhily的变异趋势具有 参考价值。利用软件分析了分离毒株的分子量，疏水性、抗原性、表面可能性、密 码子偏爱性和二级结构等分子结构特征，并推测可能与其血凝性最相关的氨基酸位 点为p 2区的第3 0 4、3 0 5位，

5、及e区的第4 3 2位；其次是f区的第4 8 0、 5 0 8位该分析结论在国内外未见系统报道，为rhdv的分子生物学增添了新 的资料.根据g e n b a n k中的衣壳蛋白vp 6 0基因内的保守序列，用p r i m e r 5 . 0设计出1对可扩增出vp 6 0基因内部约4 9 6 b p的部分片段的引 物，建立了检测rhdv的rt pcr方法，并采用该r t-p c r方法对人工 致死家兔体内的r h d v i差t y t检测；该方法特异性强，重复性好，灵做度高, 检测rhdv的r n a的灵敏度可达2 . 1 5 u s / m 1 本研究建立的优于卧的灵 敏度高、特异性好的

6、rt-pcr方法及其p, hdv抗原检测结果在国内未见报 道本研究分离鉴定出冇不同血凝性兔出症病毒株，并对英衣壳蛋ovp 6 0基因 进行了克隆和相应生物信息学分析，建，ot检测rhd v的rt pcr方法， 为r h d v的地方毒株的分子牛物学及其结构特征增添了新的资料，并为牛产中r ii dv的检测提供了科学依据和一种灵敏、准确的检测方法.关键词：兔出血症病 毒；衣壳蛋白；vp 6 0基因；序列分析；rt-pcr检测ii四川农业人学硕士 论文 the 1 s o h f i o n and identification andthe cloning o f caps id protein

7、 v p 6 0 gene o f r h d v st r a i ns and r t p c r detect i on fo r r h d v tian lagcprevent i ve veterinary m e d i c i n e ) d i r e c ted b y pro£wang h o n g n i n g abstract：. rabbit hemorrhagic disease (ibd), which i s caused b y rabbi t hemo r r h a g i c disease v i r u s ( r )田)v). i

8、s a rat 蛔"oom e , 白 tai and contagious di s e a s e and c a 1 1 oo s a 1 o h n o u ¥ economy loss i n rabbi t 自皿她 t o c o n t r o 1 the di 鬻 as 岛 it，s n oo 觑略 ary t o i s o 1 a t e and i d _ a 俯匆 the virus 虫曲肌 and study their molecular 虫 |h| met i i 地 cha r a c t e r i s t i cs,越 we 1 1 越

9、develop a sensitive andaccuratedete c 血喀 m d枷 f orrhdv. i n this research, three s trains o f r h d v were isolated and i d e n t i f i e d from clicinal materials, which wer e named r h d v 呻融 n. 1, 2 9 3 . n e r h d v strains d i s p 1 a y e d stable pathogenic ity after 3 passages i n vivo. the 础

10、 m)b n 2 shows hi . g h hemagglutinin valence o f 1 : 6 4 0, b u t w h n i and w h n 3 show 1 o w hemagglufininv a1 e n c e o f1：5,i：10 r esp e c t i v e 1y . l i mpi dp r e c i p i ta t i o nma n i fes t c oo b e s;e e n dur in g i d e n t if i c a ti on o f3 础 m i v isola t i0n sb y agp a nd c o u

11、 ni te r c tmlent i mm un o e 1 ect ro p h o r e s i s，勰 w e 11v i r1o n with ad i a m ete ro f about3 0 n m 啪b eo b ser v e d i nthe e 1ec tr o n micros cope.us i nga p a i f of 2 1 b p1x ei m e r¥to锄 p1 i鸟49 6b p fra g m e n t si t u a t1n gthe interi o r ofconser v e d rhdv caps1d pr o t e i

12、 n v p'6 0 g en es e que n c e , t he r t-p crm et h o d w a s se t u p to te s tth e曲咖i c d is t r i but io n o f rhdvrna i nk i1 1 edb y rhdv-w h n 21mme d i a t e 1 yafter*q 土甘m i五ng懿p e蛔c on d i t i0n s .,m s p e 商 c di f f e re nt s ampies o frabbi tsf ia g m e n t a bout 50 0b p1 :n length

13、couldbe am p 1 i f i e db y t hi smethod.l 1 地 r t - p c r met ho d i s speci f i c ,r ap i dan d s e n s it i v e rat ei s 2 15 n g .j n i o trhd vte m p 1 a t ec d n a , the re f o r e , t h is metho 、d i sus e f u 1 f or c 1 i n1c di a g jiil o s e an d m o1 ec u 1ar q d i d e mi o 1 o g yinvest

14、igat ion o f r h d v . furthermore, 11 峙1 虫 llll'd c 1 eo f rhdv whn 1'2,3 swains w懿a出删from liver samplesof rabbits. the c a p s i d pr o t( e i n v p 60gene o f 3 strains w e t o c1 o ne dinto p m d18 t vector b y r饿 r and s eq u en c e& vp60 gene o f w h n 1 , 2,3 st rains werei nsize

15、o f17 4 0 n t and encoding 579 缸respectively, the 3 sequences were m b m i t t e d t o g e n b a n k with the accession numbe £. dq0692809dq069281o dq069282.r c v and e b h s vth other 1 d 他 g i s tel r e g a rd tn d w h n 21v p 6d i no f rh d v, s o 1 a t e s in5 alignment w i 0 gene sequences

16、g e n b a n k showed1the w o r that, w i t o t i d e sequence, wi re 1 h e 96. l%homo 1 ogy, w h n the 96. 5%homo 1 ogy,whn e the 99. 4%homo 1 ogy. aln u chares h a rai2 and w h n 3 s h a1 theand w h n 31 7 r h d v s 血一ainscincluding w h n 1 , 2 , the 8 4. 7 % 8 6 . 4%nuc 1 eot3 ) and r c v shareems

17、e1 v es sharet heh i g:hho m o1ogy0f897 % 9 9 4 % f o r nu c1eoti des equ e n ce5 0vp60gento f rhdvw asa ra the rco n s erve dgeneforthe phy1 0ge n et ict ree o a 1 1th erhdvs1矗ii is 慨 d to 4gene a1o g ies 0 11th e10vdo fnuclcoti des , wh ik3 gen e a 10g:i es011th elevel o fa1n m oa c1d s .t h e re肿

18、n otn0f1c e ab m phys ic a1a nd tem p0r a重char acter1s t ic , such asiuii)vowh n -1'2 , 3str a1nss1t u at e 2 d i ff erentgen e a1ogiest he0ther two m e m b er s0f啦0 v im s ofcalic1v iri d e homo 1 ogy, and share the 6 9 . 0 %5 7 0 . 5 % am i n o 础 hom0 109y,b ut the r h d v io 1 a t e st hi d a

19、 e family,rev and e b h s v, p a r a 1 lei t o rh d v and form 2 different genealogies b o t h oil thelevel o f nucleotides andiii四川农业大学硬士论文锄i oo a d ds .the a n a 1 yt i cr e s 11 1t sabovea oo u se f u1 forrecogn 逝 the v ar i a tion t e n de n c y of足日 d 驴the fol lowingmolecu1 a r structure charac

20、teristic o f r h d v w) m 1 . 2 , 3 suab 够， molecular mass, i s o e 1 e c仃 ic pcdlltjhyd rophob i c i ty, t ransmemb ranehe11c e s ,h ydr0p h i 1 i c it y,f1ex i b1 e 他一g10nsam i g en ic1ty ,飘响oo p r0 ba b11i t y ,dx1 0 inb1as2 d- st ructu r e a oo a na 1y zed1 n n1h.n gb101nfo r m af icss o f t w a

21、 re ,a n <dth e am1n oac1dsi t e 1°c 1at1n g t o h蜘明gg 1晒iifii.w e r <su p :p (3sedt o矶吗n g304,305,432 ,4 8095 0 8the resu1tscomp ose0f new s up p1 emen t f0rt hem01ec u 1 arb10logy i n fo rm ad0n o frhd v.keywords：rh d v；caps i dp ro te1n ； v p60g enes sequence analysis； r t-p c r i v 论文

22、独创性声明本 人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文屮不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其他教育机构 的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：1蓟多良 於年钳；才日关 于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学的有关保留、使用学位论文的规 定，b|j：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被杳阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编

23、学位论文。 同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分 内容。研究生签需：1蓟 淀 知£年阳多6|_1如渊萼导师酶妙达 四川农业大 学硕士论文1 前言1 . 1兔出血症概述 兔出血症(rabbit hemo r r h a g i c disease ,r hd)是由兔出血症病毒(r h d v)引起的兔的 种急性毫度接触性传染病，以呼吸系统出血、实质器官水肿、淤血及出血变化为 特征，该病传播快，发病急，发病率和死亡率极高.该病于1 9 8 4年首先在我国 江苏等地暴发，随即蔓延到全国多数地区，国内学者命名为兔出血症(船)，俗称。 兔瘟0 1 9 8 6

24、年来，意人利、法国，苏联、西班牙和徳国等国家相继暴发 该病，现加v已波及亚洲，欧洲、北美洲和非洲的四十多个国家，伽咖唧嘲删1嘲渊 口町，是养兔业的严重威胁.1 9 8 8年布达佩斯兔科学会议对该病迸行了专题讨 论，并建议统一采用我国的命名；1 9 8 9年，国际兽疫局(0 i e)将该病列入“国 际动物保健编冃"b类传染病，我国农业部9 6号令颁布为二类疫病.对rhd v 的分类，曾一度争论，将其列入小rn a病毒(picornavirus)、细 小病毒(parvovi r u s )订hi或和类细小病毒(parvori r u s 1 i k e agent) oo和嵌杯病毒(ca

25、li civirus)洲删嘲等.随着 对病毒形态、基因组结构与功能认识的深入，1 9 9 5年国际病毒分类委员会(i c t v)在第6次分类报告中正式确立了 rhdv在病毒学中的分类地位，将其归 类于嵌杯病毒科(caliciviridae), 2000年(第7次报告)乂 进一步列为恢杯病毒科兔病毒属(lagovi r u s ),属于同一属的病毒还有 欧洲棕色野兔综合征病毒(髓 i s v)删咖嘲删，以及新近报道的兔嵌杯状病毒(rcv )嘲叫.兔出血症病毒在氯化锥中的浮密度为1291. 3 4 9 /c m 3 ,沉降系数为8 51 6 2 s .对乙醸、氯仿有抵抗力嘲；能够耐受5 0 &#

26、176;c 6 0 r a i n , p h 3 03 0 r a i n , 2 % n a 0 h 3 0 r a i n , 3 %福尔形林6 0 r a i n的处理，对胰蛋白酶不敏感；对12 9沖醛作用2 5小时。 1 0 %漂白粉作用23小时。2 %戊二醛作用1小时或1地氧化钠作用3 . 5小 时均可以灭活病毒.现有研究结果表明，世界范围内的所有病毒分离株似乎属于同 一血清型阳“1,无论是遗传特性还是抗原性都极其稳定，借助现有实验手段尚不 能将不同地区的分离株区分开來.rhdv像人类的杯状病毒一样，难于进行细胞 培养，至今尚未真正找到一种能使其长期稳定传代的细胞。人工感染初生和成

27、年大 鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠等实验动物，均不发病，也不能在鸡胚上增殖.吉传义嘲等（19 9 1）偶然获得一株转化的乳兔肾上皮型细胞（d j r k）是唯一的rh i ） v在传代细胞上分离培养成功的报道.。为控制该病，国内外兽医工作者已研制 出多种常规疫苗，如兔瘟组织灭活苗，、四川寝业人学硕士论文兔瘟油翼剂灭活苗 嘲、兔瘟氮氧化铝佐剂苗、兔瘟蜂胶佐剂灭活茁咖、热灭活疫苗等.随着分子生物 学的发展，国外学者止致力于采用rhdv的唯一结构蛋白基因（vp6 0）开发 多种基因工程疫苗，如大肠杆菌表达亚单位疫苗删、昆虫细胞表达亚单位疫苗删咖, 酵母细胞表达亚单位疫苗嘲咖，马铃萼表达的亚单位疫苗嘲删咖等基

28、因工程亚单位 疫苗，以及重组牛痘病毒嘲、金丝雀痘病毒嘲、黏液瘤病毒m 1删嘲咖等活载体苗虽 然现已在i珏q d v的基因工程亚单位疫苗及重组活载体疫苗方面取得很大的进 展，但这些疫苗大都实验室研究或出间实验阶段，与生产i：的实际的广泛应用还有 一定茨离，现在兔出血症的预防还是主要靠常规疫苗的免疫。1 2兔出血症病毒 的病原特性和分了生物学研究进展12. 1形态结构p, t dy病毒粒了呈 球形，无曩膜，衣壳为二十面体对称嘛''嘲，表面呈嵌杯样，电镜观察碰一i d y病 毒粒子的直径为3 24 2 n m,病毒衣壳由3 2个高56 n m的圆柱状壳粒构 成，核心直径为1 ?2 3

29、 nm,电镜下述可见少数没有核心的病毒空衣壳.郑东 等嘲利用低温电子显微术和计算机像重构技术详细研究了1疆一idv的三维结 构，发现rhdv三维结构显示了杯状病毒的典型结构特征.高分辨率的重组no r w a 1 k病毒衣壳蛋白在壳层区折叠为b桶状结构.由于删v衣壳壳层区的半 径和厚度与重绑o r w a 1 k病毒衣壳比较相近，故推测咖哝壳蛋白在壳层区也折 叠为b-桶状结构，对r皿v衣壳蛋片vp6 0所进行的二级预测表明表明该蛋自 在壳层区主耍折叠为量一结构叨.低温电子显微术显示r皿v有两种不同核心密度 的病毒颗粒一高密度颗粒和低密度颗粒嘲.三维结构显示了 rhdv高密度颗粒和 低密度颗粒农

30、壳结构相同，均显示了杯状病毒的典型结构特征，由于rhdv基因 组和亚基因组r na分别包装于病毒衣壳内，上述两种颗粒分别对应于含基因组和 含亚基因组的p, hd v病毒颗粒嘲.1.2.2病毒的血凝性r h d y能够凝集 人的各型红细胞，其中以对。a”型红细胞凝集价最低嘲，对。0”型红细胞凝集价 最耐“；对鹅、鸡、绵羊红细胞呈轻度凝集，对鸭、sm鸟、水牛，马、狗、豚鼠和小 白鼠的红细胞均不凝集；但是pj-i dv不能凝集人的脐带或胎儿的红细胞，故 推测人体的ri-mv受体与发育过程中出现的abh家族抗原有关嘲。rhdv 血凝活性可被氯胺一t、胰蛋白酶、硼氢化钠破坏，但能够抵抗氯仿、乙醸、过碘

31、酸钾、受体破坏酶和甲醛的处理人红细胞表面受体对脂溶剂敏感，而胰蛋白酶、 过碘酸钾、受体破坏酶2四川表业大学硬上论文和硼氢化钠不影响其活性嘲.但 近来有报道介绍个别毒株在不同温度下其血凝性较常规毒株不同，如1 9 9 6年， 英国学者州分离出1株rhdv要在4c才有血凝性，同年，另有学者又分离出无血凝性的唧v毒株，其流行病学、临床症状、病理变化、e l i s a及蛋白印记分 析与常规rhd v株相同。1 9 9 8年。意大剥学者分离报道了 1株与常规脯d v 毒株存在抗原差异的pj t dv分离株一rhdva，该毒株与能保护常规rhd v的单抗1h8不反应，且与常规r曲v制各的多价血清反应也较

32、弱，但应用常规 rhd疫苗仍能完全保护给毒株对免疫兔的攻击.12. 3病毒基因组结构rh d v基因组是首株被完全序列出的杯状病毒基因组嘲.oo y的核酸为单链正义 rn a，全长7 4 3 7个核昔酸，5,末端没有帽状结构，而是共价结合与感染性相 关的 vpg（vi r i o n prot e i n , genome 1 inked ）蛋片， 该蛋白的分子量为15 16kda,3，末端有p o 1 y a尾.第1 _9 n t为5， 一非编码区，最后5 9 n t为3非编码区.咖惰两个开放读码框（0 r f ）嘲， 第1 0 7044nt为5，末端的orf1,第7 025 7378为3，

33、末端的 短开放阅读框orf 2,它与orf 1的3,端有1 9个核首酸重叠。除基因组rn a外，在感染的组织和病:毒颗粒中还有一个约24 k b的亚基因组1 i na,该 rn a包含了 vp 6 0蛋白的编码区及orf 2 ,主要编码v p 6 0嘲m.另外， 亚基因组rn a与基因组rn a的5，端都共价结合着一个1 , pg蛋白.rhd v基因组0 r f 1和o r f 2的长度分别为7 0 3 5 b p和354bporf1 编码一个分子量2 5 6 kd的多聚蛋白。该多聚蛋白被酶解产生分子量为8 0、7 3, 6 0和4 3kb的4个主要多歇四，分别相应于多聚蛋白的2 c样解旋酶（

34、8 0 kd）, 一个保守区（4 3固）、3 c样蛋白和3 d样蛋白（7 3髓）以及衣壳 蛋白（6 0 kd）其中2 c样蛋白是一种与rna复制有关的螺旋酶4 13 c样蛋白具有胱氨酸蛋白酶活性，与病毒蛋白的翻译后加t有关；3d样蛋白是一种 rn a依赖的rn a聚合酶；衣壳蛋白vi嗨d是1谨珏）y唯一的结构蛋白，与抗 病毒感染的免疫反应直接相关。其屮对3 c样蛋白研究较为详细嘲叫，在大肠杆菌 表达的该酶可特异性的切割多聚蛋白，切割位点位于病毒衣壳蛋白和rna聚合酶 的连接处.利用体外转录翻译系统研究发现，orf 1编码6个非结构蛋白（kn a螺旋酶（hel）,蛋白酶（pro）、rna依赖的r

35、na聚合酶（pol）、 pl6、p23、p30）、以及结构蛋白v p 6 0和v pg。orf 2编码一个 分子量为1 2 k d的蛋白结构成分v p 1 0 ,该蛋白含量较v p 6 0要低，为碱性 蛋白，其功能可能是在病毒粒子中与病毒rn a结合.g r a n z o w, h.等口 钉通过对r h d v病毒杨d样颗粒（core fikeparticle, c l p）研究，推测该c l p可能是基因组表达不完全和由断裂的基因表达而来.3四 川农业大学硕士论文12. 4病毒的衣壳蛋白v p 6 0杯状病毒都只有一个 主要的结构蛋白一农壳蛋白vp6 0 , rhdv也是如此.杯状病毒 衣

36、壳蛋白的氨 基酸序列分为 a （ b 2 1 ） , b（22 300） c（301 328）. d（3 29 343）、 e （344-434）. f （435-580）六个区域.电镜 观察rmv发现，其结构蛋口折叠成两个 主要的紧凑区域，内壳（ss h e 1 1 区）由v p 6 0的n端组成。容纳和保护基因组，包括a和b区；外壳（p2区） ftlvp 6 0的c端组成，包括c、d, e、f区，该端暴露在病毒表面，编码病毒 的主耍抗原决定族.1998年，j. l mart i n e z 一torrecuad r a d a等发现了衣壳上的两个主要抗原区分别位于vp6 0蛋白n端第3 1

37、.2 5 0位和c端第4 7 7 5 7 9位氨基酸z间.e. v i a p 1 a n a等咧发现vp 6 0蛋白氨基酸（包括蛋白质的前1 7 5个氨基酸）与抗血清反应强度最 强，是其他区域（蛋白质竣基端）的1 0 1 0 0倍，故推测vp6 0竣基端的抗 原结构主要是依赖于构象决定族的b细胞位点，而氨基端则是线性的抗原决定族, 在病毒感染和灭活疫苗的免疫中诱导机体产生免疫应答.r f 1 ） v的衣売由 1 8 0个拷贝的6 0 kd的多肽聚合而成，至今国外已有多个实验室分别在昆虫细 胞、植物和酵母中成功表达了可h发聚合成病毒样颗粒（v h u s -l i k e p ar t i c

38、 1 e s , vi肌）的r b ） v的衣壳蛋白删嘲嘲，v l p s不含有r n八、 而在物理形态和免疫原性上与完整的自然野毒株完全相同，这为疫苗研制和诊断提 供了原料.国内在rhd v的基因工程疫 苗方面的研究才刚起步，刘怀然（2 0 0 2年），向华咖（ 2 0 0 4年），陈兴祥ii叮（ 2 0 0 5年）分另f采用rt- p c r法克隆和测序了不同pj 1 dv毒株的vp6 0基因，不同毒株显示了高度 同源性.严维巍润，崔治中等n町（ 2 0 0 3年）将rhd v . wx 8 4株的vp 6 0基因分别克隆到表达性载体p g e川p 1、p e t 5 ,以及杆状病壽和酵母

39、 中进行表达，预期的蛋白均获得到了高效 表达.13兔出血症病?炯锻夥椒（1难 芯拷？兔出血症传播快，发病率和死亡率极高，临床表现发病突然、尖叫、死亡急, 死前有神经症状.病变特点是各组织器官弥漫性的点状出血和实质器官的淤血、水 肿和变性咖.根据临床特点和病变特点可作出初步诊断，确诊需经实验室检查，可 通过检测病死兔组织中的病毒或病毒抗原进行确诊.1.3. 1常规检测方法1. 31电镜检杳：病兔的肝脏含毒爨较高，故其匀浆后经粗提后作为诊断的 原始材料，经负染后电镜观察可见大量典型的杯状病毒粒了，直径为3 2 - 3 5 n mw ao电镜的直四川农业人学硕士论文接观察法还可通过pj q dv的特

40、异性 抗体或单克隆抗体诱导病毒粒子形成凝集块便于观察鉴定嘲哪咖咖.此外，出口的 兔肉匀浆冻融后用p e g浓缩5 0 - 1 0 0倍，离心取上清电镜检测是否带 毒13. 1. 2血凝试验和血凝抑制试验“咖嘲s多数人习惯使用人的。0"型 红细胞，据杨汉春等报道，使用人的不同血型新鲜红细胞所得结果无明显差异，亦 可将人的红细胞通过高猛酸钾i古i定后使用.辛盛鹏fi哪，郑厚旌嘲，张再清咖等报 道使用用醛化红细胞作卧，效果良好眦试验简便、快速、不需特殊仪器，在诊断 和免疫效杲测定屮广泛应用，但h a的缺点是，影响因素较多渊，且现己发现有些 病毒分离株不产生血凝现象，徳国和意人利学者报道ha

41、有8 %的假阳性或假阴 性肛试验的特异性及敏感性好，可用于流行病学调查和疫苗免疫效果检测，多采 用b法血凝抑制试验术式；也可用于可疑病毒的血清学鉴定，此时多采用a术 式1. 3. 1. 3琼脂扩散试验：矫止德，罗满林咖等用病死兔肝脏乳剂制备的 冻融抗原对感染病毒的兔血清进行木试验，检出了沉淀抗体.戴康等发现，以甲醛 灭活制备的抗原与抗血清反应时，粗提抗原可出现2-3条沉淀带，高度提纯的抗 原则只出现i条带。但木试验要求病毒抗原提纯浓度较高。3. 1. 4对流免 疫电泳：张洪英（ 2 0 0 0年）嘲用粗提病毒与抗血清作对流电泳，正极加病毒液, 负极加抗血清，电泳2 h后出现沉淀线，同时该法也用

42、于快速提纯兔瘟病毒跚.此 外，国内外学者还建立了多种检测诊断方法，如荧光抗体染色嘲、酶标抗体技术、 免疫金银法染色、酶联免疫吸附试验（elisa）嘲钏九.13 . 2分子牛物 学检测方法g u i t t r e等删以5,末端衣壳蛋白基因为对彖设计了rt p cr方法，结果说明木法比elis a放感1 0 1倍，可以检出少至12个拷贝的模板c dn a. 2 0 0 1年，g a 1 1 r e c u 1 e , g.等创建了免疫捕获r t-p c r方法，先用抗rhdv高免血清包被elisa板，然后加入感染兔肝 悬液进行捕获，接着在el i sa孔中直接进行反转录，最后在取出反转录产物进

43、行常规p c r,本法比常规el i s a敏感1 0 1 0 0倍，适于大批量样品的分 了流行病学调杳.2 0 0 2年，刘光耀，杜念兴等嘲采用p c r-e l i sa方法 检测rhdv在djrk细胞上的增殖规律，该法将pcr、液相杂交和elis a结合起来，在pcr扩增反应中加入地高辛，然后用特异性探针进行液相杂交， 再加入标有碱性磷酸酶的抗体和发光底物，通过测定颜色反应，从而量化样品中的 模板.,四川农业大学硕士论文 另外，g e 1 me t t i , d.等嘲以d i g o x i g e n i n标记的r n a探针建立了原位杂交技术检 测组织中的r h d v分 布，肝细胞检测为阳性，但脾脏检测为阴性，这与以往报道不符。但k i mu r a , t.等同样用非放射性的原位杂交技术同时在肝、脾和肺屮检测到病毒核酸，且发 现巨噬细胞中也存在着病毒的复制。在上述多种检测方法中，常规检测方法可用于 检测抗原、抗体及抗原分布等，操作简单，不需要过于特殊的仪器设备，成木较低, 适合基层中的一般性检测,但其检测的灵敏性和特异性有限。分子生物学检测方法, 尤其rt-p c r技术，是一种应用很广的病毒检测技术，在疾病诊断中发挥着重 要作用，该方法具有诊断快速、灵敏度高、特异性强