从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定

1、从土壤中分离纯培养微生物并作初步观察鉴定笑嘻嘻(闽南师范大学生科院食品质量与安全14级363000)摘耍：熟练分离纯化微生物的基本操作技术，并对土壤中的微生物进 行分离与纯化，根据菌落形态观察及一系列的牛理牛化结果，对照种属特 征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。关键词：细菌、霉菌、放线菌、培养基配制、高压蒸汽灭菌、干热灭菌、平板划线、斜面接种 isolated from soil microbial and pure training preliminary observation appraisal experimentreport笑嘻嘻(food quality and safety

2、of fujian normal university academy 14363000)abstract:skilled purification microbial the basic operation of thetechnology, and the soil of the microbial separation and purification, according to the colony morphology observation and a series of physiological and biochemical results, the comparison s

3、pecies features of separation and purification preliminary identification of microbial subordinate groups.key words:bacteria, mould, actinomyces, culture medium preparation, high-pressure steam sterilization, dry heat sterilization , flat crossed, cant vacci natio n生活中的微生物无处不在，某些微生物给人们带來困扰，但更多的微 生物对

4、我们人类有必不可少的作用。为了生产和科研的需耍，人们往往需 要从自然界混杂的微生物群体中分离岀具有特殊功能的纯种微生物；或重 新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通 过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株 纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培 养物中所有的细胞或泡子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离 纯化技术主要由采集样品、培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组 成。1材料与方法1丄培养基的配制1.1.1.细菌培养基的种类细菌、放线菌、酵母菌三类微生物培养基的配制1.1.2实验材料和用具牛肉膏、蛋白月东、

5、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、氯霉素、 lmol/lnaoh> lmol/lhcl kno3> nacl、k2hpo4.3h2o、mgso4.7h2o> fes04.7h20o试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、枪头、移液枪、培养皿、棉花、 接种环、记号笔、线绳、纱布。1.1.3培养基的配方(-)牛肉膏蛋白腺培养基的配制牛肉膏蛋白腺培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。配方:牛肉膏3g、蛋白月东10g、naci 5g琼脂1520g、水looomk ph7.47.6。1、称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。 牛肉膏和蛋口月东可分别放在小烧杯或

6、表面皿中称量，用热水溶解后倒入大 烧杯。蛋白月东极易吸潮，故称量时耍迅速，并及时把试剂瓶盖紧.2、加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上， 小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若 配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融化，在 此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。3、调ph用ph试纸或酸度计检测培养基的ph值，若ph偏酸，可 滴加lmol/l naoh,边加边搅拌,并随时检测,直至达到所需ph范围。若 偏碱，则用lmol/lhci进行调节。ph调节通常放在加琼脂之前。注意ph 值不要调过头，以免回调而彫响培养

7、基内各离子的浓度。4、过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热 过滤，以利培养结果的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5、分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。（分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。）分装量：固体培养基约为试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。6、加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度耍合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌 侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防 棉塞脱落。

8、有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有 时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7、包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以 防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养 基的试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基 名称、组别、日期。8、灭菌 将上述培养基于121.3oc湿热灭菌20mino如因特殊情况不 能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9、摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木 条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；待其凝固。10、无菌检查 将灭菌的培养基放入37oc温箱中培养2448h,无菌

9、生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。（二）高氏1号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉 20g, kno3 lg, naci 0.5g/k2hpo4.3h2o 0.5g, feso4.7h2o o.olg,琼脂 1520g,水 1000ml, ph7.47.6。1、称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小 烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继 续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。对微量成分feso4.7h20可先配 成高浓度的储备液后再加入力法是先在looml水中加入lg的feso4.7h2o

10、, 配成浓度为o.olg/ml的储备液'再在loooml培养基屮加入以上储备液iml 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体 培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋口陈培养基配制。2、ph调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白月东培养基配制。（三）马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：k2hpo4 lg, mgso4.7h2o 05g,蛋白腺 5g,葡萄糖 10g,琼脂 1520g, 水1000ml,自然ph1、称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在 少于所需量的水中。待各成分溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉

11、红配成1%的水溶液，在loooml培养液中加入以上孟加拉红溶液33ml,混 匀后，再加入琼脂加热融化,方法同（一）2、ph调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同（一）。3、氯霉素的加入 氯霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融 化待温度降至45oc左右时才能加入。可先将氯霉素配成1%的溶液（配好 的氯霉素溶液保存于-20oc）,在100ml培养基中加入1%氯霉素0.3ml,使 每毫升培养基中含氯霉素30 u go1.1.4 土样取自闽南师范大学瑞京公寓芒果树，地下10cm-15cm1.2消毒和灭菌 1.2.2高压蒸汽灭菌i自动立式压力蒸汽灭菌器的操作步骤1-1装料 开盖，把包扎好的灭菌物品放在灭

12、菌桶内的筛板上，灭菌 包体积一般不超过20cmx：l0cmx10cm为宜，各包之间留有间隙，以利于蒸 汽穿透。在堆放灭菌包时应注意安全阀、放汽阀孔位置必须留出空位，保 障其畅通放汽，否则因安全阀出气孔堵塞不能工作造成事故。1-2开机1-2-1加水：接上木机标牌一致的电源，将控制面板上电源开关按至 on处，此时断水灯（黄色）亮，显示电源己正常输入。低水位灯（红色） 亮，显示蒸发锅内处断水状态，然后将灭菌桶盖罩住灭菌桶，把生活用水 从灭菌桶与蒸锅夹缝内加入，当水位达到高水位时，以上两灯同时灭。此 时，应继续加水到高水位灯（绿色）亮时停止。1-2-2设定温度：数显窗内，红色数显为灭菌桶内温度，绿色数

13、显为设 定温度。按动控制板上增加键或减少键，可在绿色数显上设定所需温度, 按动位移键可将闪烁的绿灯数显进位移位设定，当每次所需温度结束吋, 须按一下确认键进行确认，即可完成设定。此时，红色数显随着蒸发锅内 温度上升而变化。1-2-3设定时间：温度设定完毕并按确认键后，绿色数显切换成定时状 态，按位移键定位，然后再按增加键和减少键，设定所需的保温时间，设 定完毕后，须按一下确认键进行确认。保温时间采用倒计时，当灭菌锅内 温度达到设定温度时，定时器才开始计时。如在运行过程中耍查看时间数 和设定温度数，只要按一下确认键，便可切到所需的数显进行阅读。13 密封：以上操作完成后，将压板完全推入固定柱内，

14、将手轮向右旋紧，使 盖与主体密封。1-4灭菌1-4-1排气：为了保证温控仪与灭菌室温度的一致，应将灭菌室内的冷 空气排除干净，具体可在加热开始时打开放气阀，待水煮沸后，水蒸气和 空气一起从排气阀孔排出，一般认为，当排出的气流很强并有嘘声时，表 明锅内空气已排净（沸后约5min）,然后关上排气阀。同时将下排气阀稍 稍的打开，让微量的蒸汽通过下排气阀在整个灭菌过程中不断排出，这样 有利于灭菌室上下部温度保持同步。1-4-2当设定时间结束时，电控装置自动关闭加热电源，并伴有蜂鸣提 醒。此时，应将电源关闭。1-4-3灭菌结束后，待其冷却，直至压力表指针回复至0位后，打开排 放气阀再待数分钟排去余汽，才

15、能将盖打开，取出灭菌物品，排掉剩水。1.2.2干热灭菌法干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、过滤器、移 液管等的灭菌。使用的仪器为干热消毒箱。1、装入待灭菌物品预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养 皿筒、移液管筒内，然后放入消壽箱中，关闭箱门。2、温度与时间的设定 打开电源开关，在控制烦板上对温度和时间 进行设定，本实验所需温度为160-170oc,当温度上升到所设定的温度后， 计时开始，一般设定时间为223、灭菌过程 当温度上升到设定的温度后，维持所需（设定）时间，设定时间一结束，数显示窗显示“end”，加温电源切断，并有声音提醒, 关闭电源。4、取出灭菌物品 待消毒箱 温

16、度降到70oc以下后，才能打开箱门， 取出灭菌物品。1.3 土壤微生物的稀释分离纯化、无菌操作技术、微生物菌落的观察及初步鉴定1.3.1 土壤稀释分离1、取土壤取表层以下5-10cm处的土壤样品，放入灭菌的袋中备用，或放在4oc 冰箱暂存。2、制备稀释液（要无菌操作）（1）制备土壤悬液：取土样0.5g,迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），振荡5-10min,使土样充分打散，即成102 的土壤悬液。（2）稀释：用无菌移液管吸102的土壤悬液0.5ml,放入4.5ml无菌水中，即为103稀释液，如此重复，可依次制成10-310-7的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一

17、个稀释度换一支移液管，每 次吸土液，要将移液管插在液曲，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一 次，以减少稀释中的误差。示意图如下：0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml 0.5ml10-210-310-410-510-610-7稀释过程示意图（图中左侧梯形为三角瓶，其中加入49.5ml无菌水与0.5g 土样，土 壤溶液稀释度为10依此类推，右侧三试管屮土壤稀释度分别为：10、10、 10、10、10-3-牛567-2 ）3、混菌法测定菌落数的方法（1）细菌：在洁净工作台内，取10-7. 106两管稀释液各lml,分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度做两个平皿。然后取冷却至50°c的牛

18、肉膏蛋白腺培养基，分别 倒入以上培养皿中（装量以铺满皿底的2/3为宜），迅速轻轻摇 动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼 脂凝固即成细菌平板，倒平板时要注意无菌操作，倒平板的方 法见图3-lo（2）放线菌：取10-5> 10-4两管稀释液，在每管中加入10%酚液56 滴，摇匀，静置片刻，然后分别从两管吸tb lml加入相应标号的平皿中， 选用高氏1号培养基，用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放线菌 平板。（3）霉菌：取10-2. 103两管稀释液各lml,分别接入相应标号的 平皿屮，每个稀释度接两个平在熔好的马丁氏固体培养基屮，每100ml 加入灭菌的乳酸lml （

19、淡黄色），轻轻摇匀；再滴入0.3 ml,摇匀，然后用与细菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌平板。（4）酵母菌*若土样取自果园或菜园的土壤，在（3）即可能分离到。4、培养将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放 置，于2830°c恒温培养，细菌培养12d,放线菌培养57d,霉菌35d。 便可观察菌落特征并计数，各培养物可用于进一步纯化分离或直接转接斜 面。板划线分离微牛物1.1.2平板划线分离微生物1、倒平板 按无菌操作要求，在洁净工作台或在火焰旁操作，取融 化并冷却至不烫手的固体培养基（约50oc）,倒入无菌培养皿，倒量以铺 满皿底为限，平放待其冷却凝固，备用。补充无菌操

20、作：紫外灭菌30min 风机打开一5 min后可开始操作一75% 酒精消毒挥发后再点酒精灯一酒精灯无菌区r=5cm2、划线分离使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾 取少量菌样，在相应培养基平板划线分离（如图），划线的方法多样，目 的是获得单个菌落。3、培养方法同“土壤稀释分离”。4、菌落观察 从培养好的未知平板中，挑选8个不同的单菌落，逐个 编号，根据菌落识别要点区分未知菌落类群，并将观察结果填入表41。1.3.3斜面接种（掌心、斜面向上，管口灭菌一右手无名小指拔塞一底部至顶部划z字一管口硅塞灭菌）1、取装有已灭菌的固体斜面培养基试管，分别做好标记（写上菌名,日期、接种人等），然后

21、用无菌操作方法，把待接菌种接入以上培养基 斜血中。2、接种方法 用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之” 字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部。注意划线要轻，不可把 培养基划破。3、接种后恒温培养，方法同（一）402结果与分析（-）菌落数观察记录表表1（二） 未知菌落的形态观察记录表表2三类微生物菌落的基本特征表33总结与讨论一、注意事项1、在配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免金属离子进入 培养基屮，影响细菌生长。2、使用高压灭菌锅应严格按照操作程序（加水、排冷空气、降零） 进行，避免发生事故；灭菌时操作者切勿擅自离开。3、干热灭菌时消毒箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气

22、流通而 影响灭菌效果；灭菌物品不耍与消毒箱内壁的钢板接触，以防包装纸烤焦 起火。4、从芒果树土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度。5、在土壤稀释分离操作屮，每稀释10倍，更换一次移液枪，使计数 准确。6、观察菌落特点时，要选择分离得很开的单个较人菌落，对培养皿 和试管要编好号码，请勿随意移动开盖，以免搞混菌号。7、在无菌操作台操作时，不可大声喧哗，试验器材与双手不能离开 操作台，头不能进入操作台。一切操作都耍靠近酒精灯进行。8、使用接种环画线时，切记不要将培养基划破。二、问题与讨论1、培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如 何处理？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？%1 培养基配

23、置完成后就具备了营养功能，在空气中会有很多胞子等落 进去，如果放的时间长了，等微生物生长了，营养成分就降低了，而且营 养结构也变化了。再就是有些特殊的培养基，里面各种物质不灭菌也就是 不加热的话，彼此反应，这样就达不到最后的营养结构了。%1 培养基不及时灭菌，一般就不能再用了，你可以倒进垃圾桶或者指 定的地方，也可以把它灭菌后用于比较低级的微生物培养。节约起见， 做肥料了啥的都可以啊。%1 通常是放在37°c的恒温箱中一两天后 培养基上没有生长任何微生 物的就可以使用（若有微生物则是以菌落出现的肉眼可以看见的）。2、在马丁氏培养基屮加入氯霉素的目的是什么？马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基，抑制放线菌和 细菌的生成，对真菌无抑制作用，从而达到分离真菌的冃的。3、高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤 然快速降压？在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三： 一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加, 所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热 存在，每1克水在100°c时，由气态变为液态时可放出226kj （千焦）的 热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌